Un protocolo simple para la extracción de hemocitos de orugas silvestres
Summary
Hemocitos Insectos llevar a cabo muchas funciones importantes, tanto inmunes y no inmunes, en todas las etapas de desarrollo del insecto. Nuestro conocimiento actual de los tipos de hemocitos y la función proviene de estudios en modelos genéticos de insectos. A continuación, se presenta un método para la extracción, cuantificación y visualización de hemocitos de larvas silvestres.
Abstract
Hemocitos de insectos (equivalente a mamíferos células blancas de la sangre) juegan un papel importante en varios procesos fisiológicos durante el ciclo de vida de un insecto 1. En las fases larvarias de insectos pertenecientes al orden de los lepidópteros (polillas y mariposas) y dípteros (moscas verdaderas), hemocitos se forman a partir de la glándula linfática (un órgano hematopoyético especializado) o células embrionarias y se puede llevar hasta la etapa adulta. Hemocitos embrionarias están involucrados en la regulación de la migración celular durante el desarrollo y la quimiotaxis durante la inflamación. También participan en la apoptosis de células y son esenciales para la embriogénesis 2. Hemocitos mediar en el brazo celular de la respuesta inmune innata de insectos que incluye varias funciones, tales como la propagación de células de agregación celular, la formación de nódulos, la fagocitosis y la encapsulación de los invasores extraños 3. Ellos también son responsables de orquestar específicas defensas humorales de insectos durante la infección, como la producción de péptidos antimicrobianos y otras moléculas efectoras 4, 5. Hemocyte morfología y función han sido estudiada principalmente en modelos de insectos genéticas o fisiológicas, incluyendo la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster 6, 7, el Aedes aegypti y Anopheles gambiae 8, 9 y el gusano del tabaco, Manduca sexta 10, 11. Sin embargo, existe poca información que existe actualmente sobre la diversidad, la clasificación, morfología y función de hemocitos en especies de insectos no-modelo, en especial los de origen silvestre 12.
Aquí se describe un protocolo sencillo y eficiente para la extracción de hemocitos de larvas silvestres. Utilizamos penúltimo estadio Lithacodes fasciola (amarillo de hombros polilla slug) (Figura 1) y Euclea delphinii (espinosa babosa roble) orugas (Lepidoptera: Limacodidae) y muestran que los volúmenes suficientes de hemolinfa (sangre de insectos)puede ser aislado y números de hemocitos contados a partir de larvas individuales. Este método puede ser usado para estudiar eficientemente tipos de hemocitos en estas especies, así como en otras orugas de lepidópteros relacionados recolectadas desde el campo, o se puede combinar fácilmente con ensayos inmunológicos destinados a investigar la función de hemocitos después de la infección microbiana o con organismos parásitos 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos para la extracción de hemocitos de los insectos de importancia médica y los insectos lepidópteros modelo han sido previamente informado de 9, 14. Métodos de extracción de hemocitos se adaptan de acuerdo con la especie de insecto, la etapa de desarrollo del insecto y sus características morfológicas. Por ejemplo, el aislamiento hemolinfa de las larvas de Manduca puede ser fácilmente realizada por cortando el cuerno curvado cerca del extremo del abdomen 15. Porque las or…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TMS fue apoyado por la beca Harlan Trust (GWU) durante este estudio. La financiación para la recolección de campo y la cría de L. fasciola y E. delphinii fue proporcionado por la NSF subvención DEB 0642438 a JTL.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace’s Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32”, ID: 1/32′ |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1″ length |
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