נוהל אופטימליים עבור Fluorescence המופעל בידוד מיון (FACS) תא של אבות עצביות האוטונומית מאיברים בטן של עכברים עוברית
Summary
הליך אופטימיזציה לטהר עצביים לפסגה הנגזרות אבות עצביים מרקמות העכבר העובר מתוארת. שיטה זו מנצלת את הביטוי של אללים הכתב ניאון לבודד אוכלוסיות נפרדות על ידי מיון הקרינה המופעל תאים (FACS). הטכניקה ניתן ליישם על מנת לבודד subpopulations עצביים לאורך ההתפתחות או ברקמות בוגרים.
Abstract
במהלך ההתפתחות העצבית לפסגה (NC) הנגזרות אבות נוירונים נודדים מן הצינור העצבי ליצירת הגרעינים האוטונומית באיברים כמו המעי בטן ועל דרכי השתן התחתונות. הן במהלך פיתוח ברקמות בוגרים תאים אלה הם לעתים קרובות מפוזרים באופן נרחב בכל הרקמות, כך בידוד אוכלוסיות נפרדות באמצעות שיטות כמו לכידת לייזר מיקרו לנתיחה קשה. הם יכולים עם זאת דמיינו ישירות על ידי הביטוי של עיתונאים המונעים על ניאון מאזורים הרגולציה של נוירון גנים ספציפיים כמו hydroxylase טירוזין (ה '). אנו מתארים את שיטת אופטימיזציה עבור תשואות גבוהות של TH + קיימא אבות עצביים מרקמות העכבר בטן העובר, כולל המעי בדרכי המין ודרכי השתן התחתונה (LUT), המבוסס על דיסוציאציה הקרינה המופעל מיון תאים (FACS).
ה 'הגן המקודד את האנזים מגביל את שיעור לייצור catecholamines. אבות עצביים אנטרי מתחילים להביע TH durלאינג ההגירה שלהם במעי העובר 1 ו TH נוכחת גם משנה של נוירונים בוגרים הגרעינים האגן 2-4. ההופעה הראשונה של שושלת זו לבין חלוקת נוירונים אלה בהיבטים אחרים של LUT, ובידוד שלהם לא תוארה. אבות נוירונים המבטאים TH ניתן דמיינו בקלות על ידי ביטוי EGFP בעכברים נושאי מבנה transgene Tg (TH-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. אנחנו צילמו ביטוי transgene זה בעכברים עובריים כדי לתעד את חלוקת TH + תאים LUT פיתוח ב 15.5 ימים שלאחר משגל (DPC), מייעדים הבוקר של זיהוי plug כמו 0.5 DPC, ו ציין כי תת קבוצה של אבות העצבית התגבשו האגן הגרעינים אקספרס EGFP.
לבודד TH + LUT אבות עצביים, אנו אופטימיזציה שיטות ששימשו בתחילה לטהר גזע עצביים לפסגה תאים מהמעי העכבר העובר 2-6. מאמצים קודמים לבודד NC-derived אוכלוסיות לסמוך עלעיכול עם קוקטייל של collagenase ו טריפסין להשיג השעיות התא עבור cytometry הזרימה. בידינו שיטות אלה מיוצרים השעיות סלולריים מ LUT עם כדאיות נמוכה יחסית. לאור השכיחות הנמוכה ממילא של אבות עצביים ברקמות העובר LUT, יצאנו כדי לייעל את שיטות ניתוק כאלה הישרדות התא של dissociates האחרונים היה להיות מוגברת. קבענו כי ניתוק עדינה Accumax (התא טכנולוגיות חדשניות, Inc), הוראות סינון, מיון וזרימה בלחצים נמוכים אפשרה לנו להשיג שרידות גבוהה יותר באופן עקבי (> 70% של תאים הכולל של הפורום) עם תשואות הבאות של אבות עצביים מספיקים לניתוח במורד הזרם. שיטת הפעולה המתואר יכול להיות מיושם באופן כללי לבודד מגוון של אוכלוסיות נוירונים מ משני Murine רקמות עובריות או מבוגר.
Protocol
Discussion
הכתב עכבר קווים המבטאים כתבים ניאון הופכים להיות זמינים באופן נרחב באמצעות מאמצים מרובים Murine גנטיקה הקהילה 1,8,9. כתוצאה מכך שיטת ניתוק מאויר כאן יכולים להיות מיושמים באופן נרחב על בידודו של תת נוירונים בדידים המבוססים על עצבי או ביטוי דפוסי הקולטן מ משני רקמות ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות קתרין אלפורד לקבלת הצעות על התא דיסוציאציה שיטות וקווין ולר, דוד פלאהרטי ואת בריטני מטלוק על התמיכה ב משאבים תזרים Cytometry משותף באוניברסיטת ונדרבילט מרכז רפואי ומליסה א Musser לסיוע אמנותי עם איורים. אנו מודים בני הזוג. ג'ק מושר ושון מוריסון עצה יישום הבידוד של אבות עצביים. תזרים VMC Cytometry המשאב המשותף הוא נתמך על ידי אינגרם ונדרבילט במרכז לחקר הסרטן (p30 CA68485) לבין מחלות העיכול ונדרבילט מרכז המחקר (p30 DK058404). עבודה זו נתמכה על ידי ארה"ב במימון מכוני הבריאות הלאומיים מענקים DK064251, DK086594, ו DK070219.
Materials
| Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
| Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
| DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
| 10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| 10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
| Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
| BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
| Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
| 38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
| 7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
| TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
| 5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
| Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |
References
- Gong, S. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells. Cell. 96, 737-749 (1999).
- Kruger, G. M. Neural crest stem cells persist in the adult gut but undergo changes in self-renewal, neuronal subtype potential, and factor responsiveness. Neuron. 35, 657-669 (2002).
- Bixby, S., Kruger, G. M., Mosher, J. T., Joseph, N. M., Morrison, S. J. Cell-intrinsic differences between stem cells from different regions of the peripheral nervous system regulate the generation of neural diversity. Neuron. 35, 643-656 (2002).
- Walters, L. C., Cantrell, V. A., Weller, K. P., Mosher, J. T., Southard-Smith, E. M. Genetic background impacts developmental potential of enteric neural crest-derived progenitors in the Sox10Dom model of Hirschsprung disease. Human Molecular Genetics. , (2010).
- Corpening, J. C. Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression. Genesis. 49, 599-618 (2011).
- Morrison, S. J. . Isolation of fetal rat neural crest stem cells (NCSC) from gut and sciatic nerve. , (2012).
- Skarnes, W. C. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474, 337-342 (2011).
- Harding, S. D. The GUDMAP database–an online resource for genitourinary research. Development. 138, 2845-2853 (2011).
- Joseph, N. M. Enteric glia are multipotent in culture but primarily form glia in the adult rodent gut. J. Clin. Invest. 121, 3398-3411 (2011).
- Newgreen, D. F., Murphy, M. Neural crest cell outgrowth cultures and the analysis of cell migration. Methods Mol. Biol. 137, 201-211 (2000).
