En optimerad förfarande för att rena neurallist-härledda neuronala stamceller från foster musvävnader beskrivs. Detta förfarande drar fördel av expression från fluorescerande reportergrupper alleler för att isolera diskreta populationer av fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS). Tekniken kan tillämpas för att isolera neuronala subpopulationer genom hela utvecklingen, eller från vävnader från vuxna.
Under utveckling neurallisten (NC)-härledda neuronala progenitorceller migrera bort från det neurala röret för att bilda autonom ganglier i inre organ såsom tarmen och nedre urinvägarna. Både under utveckling och mogna vävnader dessa celler är ofta spridda över hela vävnader så att isolering av diskreta populationer med hjälp av metoder som laser capture mikro-dissektion är svårt. De kan emellertid direkt visualiseras genom uttryck av fluorescerande reportrar drivna från regulatoriska regioner av neuron-specifika gener såsom tyrosinhydroxylas (TH). Vi beskriver ett förfarande optimeras för höga utbyten av livskraftiga TH + neuronala progenitorceller från fetala mus viscerala vävnaderna, inklusive tarmen och nedre urogenitalområdet (LUT), baserat på dissociation och fluorescens-aktiverad cellsortering (FACS).
TH-genen kodar det hastighetsbegränsande enzymet för produktion av katekolaminer. Enteriska neuronala stamceller att börja uttrycka TH durning sin vandring i fosterställning tarmen 1 och TH är också närvarande i en delmängd av vuxna bäcken ganglier neuroner 2-4. Det första uppträdandet av denna härstamning och fördelningen av dessa neuroner i andra aspekter av LUT och deras isolering har inte beskrivits. Neuronala stamceller uttrycker TH kan lätt visualiseras genom uttryck av EGFP i möss som bär på transgenen konstruktionen Tg (Th-EGFP) DJ76Gsat/Mmnc 1. Vi avbildas uttryck för denna transgen i foster möss för att dokumentera fördelningen av TH + celler i utvecklingsländerna LUT vid 15,5 dagar efter coitus (DPC), betecknar morgonen plug-avkänning som 0,5 DPC, och konstaterade att en delmängd av neuronala stamceller i koalescerande bäcken ganglierna express EGFP.
För att isolera LUT TH + neuronala stamceller, optimerad vi metoder som ursprungligen användes för att rena neurala celler crest stamceller från foster musen tarmen 2-6. Tidigare försök att isolera NC-härledda populationer som åberopasdigerering med en cocktail av kollagenas och trypsin för att erhålla cellsuspensioner för flödescytometri. I våra händer dessa metoder som produceras cellsuspensioner från LUT med relativt låg lönsamhet. Med tanke på den redan låga förekomsten av neuronala stamceller i fostrets LUT vävnader, satte vi ut för att optimera dissociation metoder så att cellöverlevnad i finalen dissocierar skulle ökas. Vi bestämde att milda dissociation i Accumax (Innovativa Cell Technologies, Inc), manuell filtrering, och flödet sortering vid låga tryck får oss att uppnå genomgående större överlevnad (> 70% av totala celler) med efterföljande avkastningen för neuronala stamceller tillräckliga för nedströms analys. Metoden beskriver vi kan i stort sett användas för att isolera en mängd olika neuronala populationer från antingen foster eller en vuxen murina vävnader.
Mus reporter som uttrycker fluorescerande reportrar blir allmänt tillgänglig genom flera satsningar på murina genetik samhället 1,8,9. Som ett resultat av dissociation metod som illustreras här kan tillämpas allmänt för isolering av diskreta neuronala subtyper baserade på neurotransmittor-eller receptor-mönster expressionsvektorer från antingen fetala eller vuxna vävnader. Även om vi har optimerat denna metod, enligt uttryck för en fluorescerande transgen reporter, kan det också tillämpas på …
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Catherine Alford för förslag på cell dissociation metoder och Kevin Weller, David Flaherty och Bretagne Matlock för stöd i flödet Delade Cytometry Resource vid Vanderbilt University Medical Center och Melissa A. Musser för konstnärlig hjälp med illustrationer. Vi tackar Dr. Jack Mosher och Sean Morrison för råd om genomförandet av isolering av neuronala stamceller. VMC Flödescytometri delad resurs stöds av Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) och Vanderbilt Digestive Disease Research Center (P30 DK058404). Detta arbete stöddes genom finansiering från US National Institutes of Health bidrag DK064251, DK086594 och DK070219.
Reagent Name | Vendor | Catalog number | Comments |
Accumax | Sigma(mfr: Innovative Cell Technologies) | A7089-100ML | Store frozen in 1 ml aliquots |
DNase I | Sigma | D-4527 | Stored frozen at -20 °C 5 mg/ml in 1xHBSS, (Used in Quench, Quench 1:5) |
10X PBS pH 7.4 | Gibco | 70011-044 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
10X HBSS w/o Ca or Mg | Gibco | 14185-052 | Make up to 1x with tissue culture grade water then sterile filter |
Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 21083027 | |
Penicillin /Streptomycin 100X | Gibco | 15140-133 | Store aliquoted at -20 °C |
BSA | Sigma | A3912-100G | Store aliquoted at -20 °C, 100 mg/ml in water |
Biowhittaker 1M HEPES in 0.85% NaCl | Lonza | 17-737E | |
38 μm NITEX Nylon Mesh Membrane | Sefar America | 3-38/22 | Cut into ~3 cm squares. UV treat overnight to sterilize in the tissue culture hood. |
7-AAD | Invitrogen | A1310 | 1 mg/ml |
TRIzol LS | Invitrogen | 10296-028 | |
5 ml polystyrene tubes | Falcon | 352058 | |
15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
Fine Dissecting Forceps | Fine Science Instruments | 11251-30 | Dumont#5 forcep, Dumoxel, standard tip 0.1×0.06mm |
Dissecting Spoon | Fine Science Instruments | 10370-18 |