बर्फ बंधनकारी प्रोटीन जांच के लिए उपन्यास LabVIEW संचालित nanoliter Osmometer
Summary
बर्फ बाध्यकारी (IBPS) प्रोटीन, एंटीफ्ऱीज़र प्रोटीन के रूप में भी जाना जाता है, बर्फ विकास को बाधित और ऊतकों की cryopreservation में उपयोग के लिए एक आशाजनक additive हैं. मुख्य करने के लिए बैंकिंग कार्मिक चयन संस्थान की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता उपकरण nanoliter osmometer है. हम एक घर डिजाइन ठंडा एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप पर घुड़सवार मंच से विकसित की है और एक कस्टम निर्मित LabVIEW दिनचर्या का उपयोग नियंत्रित. nanoliter osmometer यहाँ वर्णित एक अति संवेदनशील तरीके में नमूना तापमान चालाकी.
Abstract
Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish1, plants2, 3, arthropods4, 5, fungi6, and bacteria7. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears11, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.
We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously9, 10, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.
To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)12. This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)10. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs5, 13. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations14, 15. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber13. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere16.
The Cold Stage System
The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).
Protocol
Representative Results
Discussion
यह काम एक कंप्यूटर नियंत्रित nanoliter osmometer है कि असाधारण तापमान नियंत्रण के साथ TH गतिविधि के सटीक मापन के लिए सक्षम बनाता है के आपरेशन को दर्शाता है. किसी भी प्रणाली तापमान के प्रति संवेदनशील, अवांछित तापमान gradients बचा जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत उपकरण में तापमान gradients से बचने के लिए, परीक्षण समाधान छोटी बूंद तांबे डिस्क ठंडा मंच (2.7 कदम) में एक छेद के केंद्र में तैनात किया जाना चाहिए. इसके अतिरिक्त, एकल क्रिस्टल छोटी बूंद के केंद्र में होना करने के बजाय किनारों के पास (ज्यादातर मामलों में, यह अनायास होगा) चाहिए. समय वर्णित निर्भरता इंगित करता है कि ठंडा दर TH रीडिंग को प्रभावित कर सकते हैं. इस प्रकार, हम समय की एक रिपोर्ट के दौरान जो क्रिस्टल समाधान करने के लिए संपर्क किया गया था ठंडा करने के लिए पहले, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ठंडा दर सहित सुझाव देते हैं. हम आम तौर पर 10 मिनट पहले इंतजार कर रहे थे नीचे 0.01 पर तापमान ramping डिग्री सेल्सियस प्रत्येक 4 सेकंड कदम.
LabVIEW नियंत्रित सहoling चरण एक औंधा माइक्रोस्कोप जो microfluidic उपकरणों thermally चालाकी से किया जा सकता है के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया था. इस प्रणाली के समाधान विनिमय बर्फ क्रिस्टल और IBPS EGFP 9, 10, 16 के साथ टैग शामिल प्रयोगों के प्रदर्शन की सुविधा. LabVIEW नियंत्रित सिस्टम एक नामित आदत डाल बिजली सर्किट के माध्यम से 3040 तापमान नियंत्रक जोड़ने के द्वारा एक Clifton चरण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. इस तरह की एक प्रणाली Davies प्रयोगशाला 17 में संचालित है. LabVIEW सॉफ्टवेयर और नामित आदत डाल Clifton चरण के लिए बिजली के सर्किट डिजाइन अनुरोध पर उपलब्ध हैं.
अंत में, हम एक nanoliter osmometer है कि संवेदनशील नियंत्रण और तापमान के हेरफेर और तापमान में वृद्धि और कमी की दर (° .002 सी संवेदनशीलता के साथ), एक LabVIEW दिनचर्या के माध्यम से वास्तविक समय विश्लेषण के लिए एक वीडियो इंटरफ़ेस के साथ समन्वय की सुविधा का वर्णन. इस प्रणाली प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दर नियंत्रित प्रयोगों कि importan हैं प्रदर्शन कर सकते हैंबर्फ के साथ बातचीत आईबीपी के कैनेटीक्स की जांच करने के लिए टी. इस तरह के प्रयोगों कई लंबी बहस IBPS की कार्रवाई की व्यवस्था के आसपास के मुद्दों को संबोधित कर सकते हैं.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध ISF, NSF, और ईआरसी द्वारा समर्थित किया गया. हम रैंडी Milford, माइकल Koren, डौग Shafer, और जेरेमी Dennison से तापमान मंच के साथ तकनीकी मदद को स्वीकार करना चाहते हैं. सॉफ्टवेयर के विकास के साथ सहायता या चेन, Di Xu, राजेश Sannareddy, और सुमित भट्टाचार्य द्वारा प्रदान किया गया. हम हमारे सहयोगियों के प्रोफेसर पीटर एल डेविस और डॉ. लॉरी ए ग्राहम सांसद आईबीपी प्रोटीन और उपयोगी चर्चा के लिए धन्यवाद करना चाहते हैं. हम भी प्रयोगशाला के सदस्यों धन्यवाद डॉ. माया बार – Dolev, Yangzhong किन, डॉ. Yeliz Celik, डॉ. नाताल्या Pertaya, Ortal Mizrahy, और अपने उपयोगकर्ता की प्रतिक्रिया के लिए Shlomit लड़का.
Materials
| Name | Company | Catalog Number/model | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution | Cole-Parmer | EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
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