LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков

Summary

Ice белков (IBPs), также известный как антифриз белков, тормозят рост и льда являются перспективными добавка для использования в криоконсервация тканей. Основным инструментом, используемым для расследования IBPs является nanoliter осмометра. Мы разработали дом-разработаны стадии охлаждения установлены на оптическом микроскопе и управляются с помощью заказных LabVIEW рутины. Осмометра nanoliter описанных здесь манипуляций температуры образца в ультра-чувствительной манере.

Abstract

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocol

0. Предварительные процедуры Стеклянный капилляр для решения инъекций. Использование капиллярного съемника (Narishige, Токио, Япония), подготовить резкий пипетки с тонким открытия из стеклянного капилляра микро трубки (Brand GMBH, Wertheim, Германия). Размер отверстия должны быть проверены путем пропускания воздуха через капилляр для получения тонкой кипящей в чистой воде. Если капиллярная закрыт, то можно открыть его, разбивая ее края. Это может быть достигнуто путем нажатия или царапины это мягко по отношению к воде, содержащей стенок трубы. Подготовка капиллярные, что открытие почти заблокированы, но достаточно открыть, чтобы позволить формирование суб-миллиметровом пузыри. Медный диск очистки. Разрушать ультразвуком медных дисков в течение 10 мин в 0,1% Micro-90 мыло (Cole-Parmer, Вернон Хиллс, штат Иллинойс, США), затем промыть дистиллированной водой. Представьте дисков в изопропанол (техническое) решение, и разрушать ультразвуком в течение 10 мин. Плавниксоюзника, высушить диски, используя фильтрованный воздух. Такая очистка этап имеет решающее значение для предотвращения загрязнения IBP между экспериментами. Двойной слой покровного стекла сборки. Покровного стекла сборка была готова предоставить для выборочного наблюдения без конденсации влаги на поверхности стеклянной крышкой. Это было достигнуто путем размещения Drierite (WA Hammond Drierite, Ксения, штат Огайо, США) частицы (2 мм в диаметре) между двумя покровные, которые затем были склеены пистолет горячего клея. Эта конфигурация предотвратить конденсацию, которые могут блокировать зрения, когда образец охлаждают до низких температур и сняло необходимость дуть сухой воздух на смотровое окно. 1. Охлаждение Этап Настройка Подключите воды на входе и выходе потока из стадии охлаждения до 4 мм внутреннего диаметра трубы Tygon (Saint-Gobain, Париж, Франция), и подключить входной воды трубы водяного насоса. Подключите 4 мм, внутренний диаметр трубы Tygon на входе системы охлаждения т этапеO поставлять сухого воздуха. В воздухе сушат в линию Drierite колонки. Эксплуатация воздушных и водяных насосов. Обратите внимание, что охлаждающие элементы не должны работать без радиатора. Включите регулятор температуры, камеры и LabVIEW рутины. 2. Подготовка проб Поместите 3-4 мкл каплю иммерсионного масла B (Каргиль лабораторий, Cedar Grove, Нью-Джерси, США) на обратной стороне 7 мм, диаметр диска меди 500 мкм, имеющих отверстия, просверленные через диск. Расположите медный диск на стадии охлаждения с боковой погружения нефть вниз. Подключите капиллярная трубка (тупой край) до 0,7 мм, внутренний диаметр трубы Tygon связан с другого конца в 2 мл стеклянный шприц (Poulten-Граф, Wertheim, Германия). Перед использованием капиллярной трубке, проверьте небольшое отверстие капилляра для того, чтобы отверстие соответствующего размера (см. предварительные процедуры). Медленно вставьте GLAсс капилляр в подготовленную IBP белка пробирку (2,4 мкМ Мп IBP-GFP в 20 мМ CaCl 2 и 25 мМ Трис-HCl при рН 8, см. ссылку 10 для подготовки деталей) и вытащить стеклянный шприц, пока стеклянный капилляр содержит 0,1 мкл раствора белка. Начать запись видео с помощью программного обеспечения LabVIEW. Вставьте острый край стеклянного капилляра (содержащий раствор белка) в одно из отверстий в медных дисков на стадии охлаждения. При наблюдении в микроскоп (Olympus, Токио, Япония, 10-кратный объектив), осторожно проникают в слой иммерсионного масла с кончика стеклянного капилляра, а затем нажмите стеклянный шприц (очень тонко), чтобы доставить небольшое количество (~ 10 п) белка Решение создать 200 мкм капли. Закройте отверстие в стадии охлаждения с двойной сборки покровного стекла слоя (см. Предварительные процедуры). 3. Измерение активности TH Предварительноесс охлаждение кнопку и установите температуру до -40 ° C. Первоначально решение капля будет ясно. При низких температурах, как правило, в диапазоне от -30 ° C до -35 ° C, цвет капли изменения, указав, что решение было заморожено. Сразу же после пробы заморожены, повышение температуры медленно, пока основная лед начинает таять. Постепенное повышение температуры необходимо, чтобы избежать превышения температуры, что может привести к полному таянию образца. Переключить на 50x цель и начать, чтобы растопить лед, регулируя температуру. Эта настройка является интерактивным, и последние шаги, как правило, осуществляется с помощью маленьких шагов температуре 0,002 ° C. Продолжайте, пока расплава монокристалл остается. Окончательный размер кристалла должна быть около 10 мкм. Самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления и точно определить на более поздней стадии анализа видео. <li> Установить температуру на несколько сотых градуса Цельсия ниже температуры плавления кристалла и начать температуры рампа с задержкой 10 минут. Отрегулируйте наращивает скорость по желанию. За это время кристалл будет подвергаться IBPs. После завершения 10 раз экспозиция мин, температура будет уменьшаться автоматически под контроль процедуру LabVIEW. Соблюдайте формы кристалла при понижении температуры. В какой-то момент, внезапный взрыв кристаллов льда могут быть обнаружены. Температура, при которой это происходит, отметил, как температура взрыва кристалла. Используйте видео анализ, чтобы определить точную температуру плавления и всплеск температуры. Во-первых, с помощью анализа видео, найти точную температуру плавления. Напомним, что самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления. Запишите этот температуру плавления в программе электронных таблиц. Затем, определить точную температуру взрыва кристалла, и документировать это значение, а также. Разница между температурой плавления и замерзания, или температура кристалла взрыв, является тепловая активность гистерезиса решение IBP. 4. Измерение зависимости от времени TH активность Следуйте протоколу, описанному в разделах 3.1-3.3 подготовить единый кристалл льда. После образования кристаллов, установить время задержки рампы по желанию, и включить рампы. Температура снизится по фиксированной ставке (в соответствии с требованиями операторов) автоматически, как только темпа задержки. Документ температуры, при которой происходит взрыв кристалла. Рассчитайте время экспозиции (время между образованием кристаллов и кристаллов взрыв). Повторите эксперимент для различных времен задержки и построить TH деятельности в зависимости от воздействия времени, чтобы оценить зависимость от времени TH деятельности.

Representative Results

Измерение зависимости от времени TH LabVIEW управлением nanoliter осмометра облегчает выполнение точных измерений активности TH. Постоянную скорость снижения температуры допускается измерение зависимости от времени TH. Точный контроль температуры включен по осмометра nanoliter имеет решающее значение для этих экспериментов. Выдержка из кристаллов льда в IBPs в растворе определяется как период времени с образованием кристаллов (конец процесса плавления) до внезапного роста льда вокруг кристалла (кристалл взрыв). Мы обнаружили, что время воздействия кристаллов льда в IBPs решающее влияние на TH деятельности. Короткие периоды IBP экспозиции (несколько секунд) производится низкой активности TH в МП IBP-GFP решение (2,4 мкм) (рис. 5). TH деятельности увеличилась с IBP время экспозиции пока не достигли плато на 4 мин экспозиции IBP. При более высоких концентрациях IBP, пластиныAu была достигнута на короткое время. Рисунок 1. Схематическое IBPs адсорбированных на льду. Принято с разрешения 10. Рисунок 2. Стадии охлаждения. A) связи на трубы на микроскопе. Б) без верхней свинца. C) схема. Рисунок 3. Скриншот интерфейса LabVIEW. ClИк здесь, чтобы просмотреть большую фигуру. Рисунок 4. График температурной стабильности. Регулятор температуры был установлен, чтобы понизить температуру 0,01 ° C каждые 15 сек. Рисунок 5. Mp IBP TH деятельности в зависимости от игрового времени экспозиции кристалла в IBPs. Каждый раз, дело в том, среднее из 3-6 экспериментов.

Discussion

Эта работа демонстрирует работу с компьютерным управлением nanoliter осмометра, что обеспечивает точное измерение TH деятельности с необычайной контроля температуры. В любом чувствительные к температуре системы, нежелательные температурные градиенты следует избегать. Чтобы избежать температурных градиентов в аппарате представлены здесь, капли исследуемого раствора должна быть расположена в центре отверстие в охлаждении медный диск этап (шаг 2,7). Кроме того, в одном кристалле должны быть в центре капли, а не по краям (в большинстве случаев, это произойдет спонтанно). Зависимость от времени описано показывает, что скорость охлаждения может повлиять на TH показания. Таким образом, мы предлагаем в том числе отчета о времени, в течение которого кристалл подвергается раствор до охлаждения, а также от скорости охлаждения. Как правило, мы ждали 10 минут до наращивает вниз температура на 0,01 ° C шаги каждые 4 сек.

LabVIEW совместно контролируемыхОлинг этапе был адаптирован для использования с помощью инвертированного микроскопа, на котором микрофлюидных устройства могут быть термически манипулировать. Эта система облегчает выполнение решений обмена эксперименты с кристаллами льда и IBPs отмеченных УЗФБ с ^{9, 10, 16.} LabVIEW-управляемая система может быть адаптирована к сцене Clifton, подключив 3040 Регулятор температуры с помощью назначенных адаптации электрической цепи. Такая система работает в лаборатории Дэвис ^17. Программное обеспечение LabVIEW и назначенный адаптации электрических схем для сцены Clifton предоставляются по запросу.

В заключение мы описываем nanoliter осмометра, что облегчает чувствительной контроля и манипуляции температуру и скорость увеличения температуры и уменьшение (с чувствительностью 0,002 ° C), согласованный с видео интерфейс, с помощью LabVIEW для рутинного анализа в реальном времени. Эта система может выполнять воспроизводимые скорости контролируемых экспериментов, которые являются importanт для исследования кинетики IBP взаимодействия со льдом. Такие эксперименты могут решить ряд давно обсуждаемая вопросы, связанные с механизмом действия IBPs.

Materials

Name	Company	Catalog Number/model	Comments
Immersion oil Type B	Cargille Laboratories	16484
Drierite	W.A. Hammond Drierite	043063 2270g
Micro 90 cleaning solution	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillary puller	Narishige	PB-7
Glass capillary tubes	Brand GNBH	7493 21	75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller	Newport, Irvine, California, United States	Model 3040	Model 3040
Light microscope	Olympus	Model BH2
10x objective	Olympus		S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective	Nikon		CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera	Provideo	CVC-140
Tygon tubes	Saint-Gobain, Paris, France		Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Germany	7 10227
GPIB-PCI card	National instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407	National instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
LabVIEW System Design Software	National instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
DiVx Author software	DiVx LLC, San Diego, CA, USA