LabVIEW-opererte Novel nanoliter osmometer for Ice Binding Protein Undersøkelser

Summary

Ice proteiner (aktørene kan), også kjent som frostvæske proteiner, hemmer isen vekst og er en lovende additiv for anvendelse ved kryopreservering av vev. Det viktigste verktøyet som brukes til å undersøke aktørene kan er nanoliter osmometer. Vi utviklet en hjemme-laget kjøletrinn montert på et optisk mikroskop og kontrollert ved hjelp av en spesialbygd LabVIEW rutine. Den nanoliter osmometer beskrives her manipulert prøvetemperaturen i en ultra-sensitiv måte.

Abstract

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition proteins, are found in cold-adapted organisms and protect them from freeze injuries by interacting with ice crystals. IBPs are found in a variety of organism, including fish¹, plants^{2, 3}, arthropods^{4, 5}, fungi⁶, and bacteria⁷. IBPs adsorb to the surfaces of ice crystals and prevent water molecules from joining the ice lattice at the IBP adsorption location. Ice that grows on the crystal surface between the adsorbed IBPs develops a high curvature that lowers the temperature at which the ice crystals grow, a phenomenon referred to as the Gibbs-Thomson effect. This depression creates a gap (thermal hysteresis, TH) between the melting point and the nonequilibrium freezing point, within which ice growth is arrested^8-10, see Figure 1. One of the main tools used in IBP research is the nanoliter osmometer, which facilitates measurements of the TH activities of IBP solutions. Nanoliter osmometers, such as the Clifton instrument (Clifton Technical Physics, Hartford, NY,) and Otago instrument (Otago Osmometers, Dunedin, New Zealand), were designed to measure the osmolarity of a solution by measuring the melting point depression of droplets with nanoliter volumes. These devices were used to measure the osmolarities of biological samples, such as tears¹¹, and were found to be useful in IBP research. Manual control over these nanoliter osmometers limited the experimental possibilities. Temperature rate changes could not be controlled reliably, the temperature range of the Clifton instrument was limited to 4,000 mOsmol (about -7.5 °C), and temperature recordings as a function of time were not an available option for these instruments.

We designed a custom-made computer-controlled nanoliter osmometer system using a LabVIEW platform (National Instruments). The cold stage, described previously^{9, 10}, contains a metal block through which water circulates, thereby functioning as a heat sink, see Figure 2. Attached to this block are thermoelectric coolers that may be driven using a commercial temperature controller that can be controlled via LabVIEW modules, see Figure 3. Further details are provided below. The major advantage of this system is its sensitive temperature control, see Figure 4. Automated temperature control permits the coordination of a fixed temperature ramp with a video microscopy output containing additional experimental details.

To study the time dependence of the TH activity, we tested a 58 kDa hyperactive IBP from the Antarctic bacterium Marinomonas primoryensis (MpIBP)¹². This protein was tagged with enhanced green fluorescence proteins (eGFP) in a construct developed by Peter Davies’ group (Queens University)¹⁰. We showed that the temperature change profile affected the TH activity. Excellent control over the temperature profile in these experiments significantly improved the TH measurements. The nanoliter osmometer additionally allowed us to test the recrystallization inhibition of IBPs^{5, 13}. In general, recrystallization is a phenomenon in which large crystals grow larger at the expense of small crystals. IBPs efficiently inhibit recrystallization, even at low concentrations^{14, 15}. We used our LabVIEW-controlled osmometer to quantitatively follow the recrystallization of ice and to enforce a constant ice fraction using simultaneous real-time video analysis of the images and temperature feedback from the sample chamber¹³. The real-time calculations offer additional control options during an experimental procedure. A stage for an inverted microscope was developed to accommodate temperature-controlled microfluidic devices, which will be described elsewhere¹⁶.

The Cold Stage System

The cold stage assembly (Figure 2) consists of a set of thermoelectric coolers that cool a copper plate. Heat is removed from the stage by flowing cold water through a closed compartment under the thermoelectric coolers. A 4 mm diameter hole in the middle of the copper plate serves as a viewing window. A 1 mm diameter in-plane hole was drilled to fit the thermistor. A custom-made copper disc (7 mm in diameter) with several holes (500 μm in diameter) was placed on the copper plate and aligned with the viewing window. Air was pumped at a flow rate of 35 ml/sec and dried using Drierite (W.A. Hammond). The dry air was used to ensure a dry environment at the cooling stage. The stage was connected via a 9 pin connection outlet to a temperature controller (Model 3040 or 3150, Newport Corporation, Irvine, California, US). The temperature controller was connected via a cable to a computer GPIB-PCI card (National instruments, Austin, Texas, USA).

Protocol

0. Foreløpige Prosedyrer Glass kapillær for løsning injeksjon. Ved hjelp av en kapillær avtrekker (Narishige, Tokyo, Japan), utarbeide en skarp pipette med en fin åpning fra et glass kapillær micro tube (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Størrelsen på åpningen bør verifiseres ved å føre luft gjennom kapillære å skaffe fint bobler i rent vann. Hvis kapillær er lukket, så kan man åpne den ved å bryte sin kant. Dette kan oppnås ved å trykke eller skrape den forsiktig mot vann inneholdende rørvegger. Forbered kapillæret slik at åpningen nærmest blokkert men er åpent tilstrekkelig å tillate dannelsen av sub-millimeter bobler. Kobber plate rengjøring. Sonicate kobber plater i 10 min i 0,1% mikro-90 såpe (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), og deretter vaske med dobbelt-destillert vann. Introduser plater i en isopropanol (teknisk) løsning og sonicate igjen i 10 min. Finalliert, tørke plater med filtrert luft. Denne rengjøring fasen er avgjørende for å unngå IBP kontaminering mellom eksperimenter. Dobbelt-lags coverglass montering. En coverglass montering var forberedt på å tillate prøven observasjon uten kondensering fuktighet på forsiden glassflaten. Dette ble oppnådd ved å plassere en Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikkel (2 mm i diameter) mellom to dekkglass som ble deretter limt med et varmt lim pistol. Denne konfigurasjonen forhindret kondens som kan blokkere visning når prøven ble avkjølt til lave temperaturer og fjernet behovet for å blåse tørr luft på måletiden. 1. Kjøling Stage Set-up Koble vannstrømmen innløp og utløp av kjøling scenen til 4 mm indre diameter Tygon rør (Saint-Gobain, Paris, Frankrike), og koble vannstrømmen innløpsrøret til en vannpumpe. Koble en 4 mm indre diameter Tygon rør til innløpet av kjøletrinn to levere tørr luft. Luften ble tørret ved hjelp av en in-line Drierite kolonne. Betjene luft og vann pumper. Legg merke til at kjøleelementer ikke skal kjøres uten en kjøleribbe. Slå på temperaturregulatoren, kamera, og LabVIEW rutine. 2. Prøvepreparering Plasser en 3-4 ul dråpe immersjonsolje B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på baksiden av en 7 mm diameter kobber skive som har 500 mikrometer hull boret gjennom platen. Plasser kobber plate på kjøling scenen med immersjonsolje siden ned. Koble kapillærrøret (den butte kant) til en 0,7 mm indre diameter Tygon rør forbundet i den andre enden til en 2 ml glassprøyte (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland). Før bruk av kapillarrør, kontrollerer den lille åpningen i kapillarrøret for å sikre at åpningen er en passende størrelse (se Preliminary prosedyrer). Sett den langsomt glass kapillær i forberedt IBP proteinet prøverør (2,4 uM Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl 2 og 25 mM Tris-HCl ved pH 8, se referanse 10 for fremstilling detaljer) og trekk glassprøyte før glasset kapillarrøret inneholder 0,1 ul av proteinoppløsningen. Begynn videoopptak via LabVIEW. Sett den skarpe kanten av glasset kapillær (inneholder proteinet løsning) i en av hullene i den kobber-plate på kjøletrinn. Mens observere gjennom mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x objektiv), nøye penetrere nedsenking oljelaget med glasset kapillær spissen, og trykk glassprøyte (svært delikat) å levere en liten mengde (~ 10 nl) av proteinet løsning for å lage en 200 mikrometer dråpe. Dekke hullet i kjølesystemet scenen med dobbelt lag coverglass montering (se Innledende prosedyrer). 3. TH Aktivitet Måling Press kjøling knappen og still inn temperaturen til -40 ° C. I første omgang vil løsningen droplet være klart. Ved lave temperaturer, typisk i området -30 ° C til -35 ° C, dråpe skifter farge, noe som indikerer at løsningen har vært frosset. Umiddelbart etter at prøven er frosset, øke temperaturen langsomt til bulk isen begynner å smelte. En gradvis økning av temperaturen er nødvendig for å unngå overshooting av temperaturen som kan resultere i den fullstendige smelting av prøven. Bytte til en 50x objektiv og begynner å smelte isen ved å justere temperaturen. Denne justeringen er interaktivt, og de siste trinnene er vanligvis utføres ved hjelp av små temperaturforskjeller trinn på 0,002 ° C. Fortsett å smelte til en enkelt krystall gjenstår. Den endelige størrelsen på krystall bør være rundt 10 mikrometer. Den høyeste temperatur ved hvilken smelting har opphørt er bestemt til å være smeltepunktet og bestemmes nøyaktig i senere videoanalyse stadium. <li> Sett temperaturen på noen få hundredeler av en grader Celsius under smeltepunktet av krystallen og begynne en temperatur rampe med en 10 min forsinkelse. Juster ramping sats som ønsket. I løpet av denne tiden vil krystallen bli utsatt for aktørene kan. Ved gjennomføring av 10 min eksponeringstid, vil temperaturen reduseres automatisk under kontroll av LabVIEW rutinen. Observere krystall form som temperaturen synker. På et tidspunkt, kan den plutselige utbrudd av isen krystall følges. Temperaturen ved hvilken dette skjer er kjent som krystall burst temperatur. Bruke video analyse for å fastslå den nøyaktige smeltepunkt og burst temperatur. Først, ved hjelp av video-analyse, finne nøyaktig smeltepunkt. Husker at den høyeste temperaturen ved hvilken smelting har opphørt er bestemt til å være smeltepunktet. Dokumentere denne smeltepunkt i et regnearkprogram. Deretter bestemmer den nøyaktige krystall burst temperatur og dokumentere denne verdienså vel. Forskjellen mellom smeltepunktet og frysepunktet, eller krystall burst temperatur, er den termiske hysterese aktiviteten IBP løsningen. 4. Måling av Tidsavhengig TH aktivitet Følg protokollen beskrevet i punkt 3.1 til 3.3 for å forberede en enkelt krystall av is. Etter dannelsen av krystallen, stille inn forsinkelsen av rampen som ønsket, og slå på rampen. Temperaturen vil synke til en fast rente (i henhold til operatørenes krav) automatisk når rampen forsinkelsen har gått. Dokument temperaturen ved hvilken krystall burst oppstår. Beregn eksponeringen (tiden mellom krystalldannelse og krystallen burst). Gjenta eksperimentet for ulike forsinkelsestidene og plotte TH aktivitet som en funksjon av eksponeringstiden for å evaluere den tid-avhengighet av TH aktivitet.

Representative Results

Måling av TH tidsavhengighet LabVIEW-opererte nanoliter osmometer forenkler utførelsen av nøyaktige TH aktivitetsmålinger. Konstant temperatur reduksjonsforhold tillates måling av TH tidsavhengighet. Den nøyaktig temperaturkontroll aktivert av nanoliter osmometer var avgjørende for disse eksperimentene. Eksponeringstiden av et iskrystall til aktørene kan i oppløsning er definert som tidsrommet fra dannelsen av krystallen (slutten av smelteprosessen) inntil plutselig vekst av is rundt krystallen (crystal burst). Vi fant at eksponeringstid iskrystallene til aktørene kan avgjørende påvirket TH aktivitet. Kortvarig IBP eksponering (noen sekunder) ga en lav TH aktivitet i Mp IBP-GFP-oppløsning (2,4 uM) (figur 5). TH aktiviteten økte med IBP eksponering tid før det nådde et platå på 4 min IBP eksponering. Ved høyere konsentrasjoner IBP, tallerkenenau ble nådd på kortere tid. Figur 1. Skjematisk diagram som illustrerer aktørene kan adsorberes til is. Vedtatt med tillatelse fra 10. Figur 2. Kjølesystemet scenen. A) Koblet til rør på mikroskopet. B) Uten øvre ledelsen. C) Prinsippskisse. Figur 3. Skjermbilde av LabVIEW grensesnittet. Click her for å se større figur. Figur 4. Temperaturstabilitet grafen. Temperaturregulatoren ble satt til å senke temperaturen 0,01 ° C hver 15 sek. Figur 5. Mp IBP TH aktivitet som en funksjon av iskrystall eksponeringstid til aktørene kan. Hvert tidspunkt er gjennomsnittet av 3-6 eksperimenter.

Discussion

Dette arbeidet viser driften av en datastyrt nanoliter osmometer som muliggjør nøyaktige målinger av TH aktivitet med ekstraordinær temperaturkontroll. I hvilken som helst temperatur-følsomt system, må uønskede temperaturgradienter unngås. Å unngå temperaturgradienter i anordningen presentert her, må prøveløsningen dråpen være plassert i sentrum av et hull i platen kobber kjøletrinn (trinn 2.7). I tillegg bør enkelt krystall være i sentrum av dråpesamleren snarere enn nær kantene (i de fleste tilfeller vil dette skje spontant). Den tidsavhengighet beskrevet indikerer at avkjølingshastighet kan påvirke TH avlesningene. Således, foreslår vi inkludert en rapport av tiden hvorunder krystaller ble eksponert til oppløsningen før kjøling, så vel som den avkjølingshastighet. Vi vanligvis ventet 10 min før ramping ned temperaturen ved 0,01 ° C trinnene hver 4 sek.

LabVIEW-kontrollerte cooling stadium ble tilpasset for bruk med en invertert mikroskop som microfluidic enheter kunne være termisk manipulert. Dette systemet forenkler utførelsen av løsningen utveksling forsøk med iskrystaller og aktørene kan tagget med ^{9 eGFP, 10, 16.} LabVIEW-kontrollert system kan tilpasses en Clifton stadium ved å koble 3040 temperaturregulatoren via en utpekt tilpasse strømkrets. Et slikt system er operert i Davies lab ^17. LabVIEW software og den utpekte tilpasse elektrisk krets design for Clifton scenen er tilgjengelig på forespørsel.

Som konklusjon, beskriver vi en nanoliter osmometer som forenkler nøyaktig kontroll og manipulering av temperatur og hastigheten av temperaturøkning og reduksjon (med 0,002 ° C sensitivitet), koordinert med en video-grensesnitt gjennom en LabVIEW rutine for sanntids analyse. Dette systemet kan utføre reproduserbare rente-kontrollerte eksperimenter som er important for å undersøke kinetikken av IBP interaksjoner med is. Slike eksperimenter kan løse flere lange debattert spørsmål rundt virkningsmekanismen til aktørene kan.

Materials

Name	Company	Catalog Number/model	Comments
Immersion oil Type B	Cargille Laboratories	16484
Drierite	W.A. Hammond Drierite	043063 2270g
Micro 90 cleaning solution	Cole-Parmer	EW-18100-11
Capillary puller	Narishige	PB-7
Glass capillary tubes	Brand GNBH	7493 21	75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller	Newport, Irvine, California, United States	Model 3040	Model 3040
Light microscope	Olympus	Model BH2
10x objective	Olympus		S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective	Nikon		CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera	Provideo	CVC-140
Tygon tubes	Saint-Gobain, Paris, France		Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml)	Poulten-Graf, Wertheim, Germany	7 10227
GPIB-PCI card	National instruments, Austin, Texas, USA	778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407	National instruments, Austin, Texas, USA	322156B-01
LabVIEW System Design Software	National instruments, Austin, Texas, USA	Version 8
DiVx Author software	DiVx LLC, San Diego, CA, USA