외부 응용 직류 전기 분야에 신경 전구체 세포 마이그레이션 속도론 분석을위한 Galvanotaxis 분석

Summary

이 프로토콜에서 우리는 galvanotaxis 동안 신경 전구체 세포 translocation을 얻은 성인 뇌의 시간 경과 영상을 사용하려면 직류 전기장의 응용 프로그램을 허용 사용자 정의 챔버를 구성하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

신경 줄기 및 성인 포유류의 뇌 전구 세포 (이하 칭했다 신경 전구체 세포) (NPCs)의 발견은 neuroregenerative 전략의 개발이 세포 multipotent과 proliferative 속성을 활용하기위한 연구의 몸 시켰습니다. 이러한 전략의 성공을위한 중요한 단계는 외인성 이식 후 병변 사이트 향해 나 CNS의 periventricular 지역에서 발견되는 내생 전구체의 반응을 향상시키기 위해 NPCs의 동원이다. 따라서, 그것은, 홍보 안내 및 NPC 마이그레이션을 강화 메커니즘을 이해하는 것이 필수적입니다. galvanotaxis로 알려진 현상​​ – 우리의 작품은 홍보 할 수 직류 전기 분야의 활용 (dcEFs)와 직접 NPC 마이그레이션에 초점을 맞추고 있습니다. 내생 생리 전기 분야는 정상적인 개발 및 상처 수리하는 동안 세포 이주에 대한 중요한 단서로 기능을 수행합니다. 의 약리 중단axolotl 배아의 횡단 신경 튜브의 잠재력은 심각한 발달 기형 ^1됩니다. 상처 치유의 맥락에서 상처 각막의 수리 율은 직접 dcEF ^2-3의 약리 향상과 혼란에 도시 된 바와 같이, 부상 후 발생하는 상피 상처 잠재력의 크기와 상관되어 있습니다. 우리는 외부 적용 dcEF에 노출되면 성인 subependymal NPCs는 체외에 신속하고 감독 cathodal 마이그레이션을받을 것을 증명하고있다. 이 프로토콜에서 우리는 높은 해상도, 단일 셀 수준에서 직접 전지 본체의 translocation (마이그레이션)의 장기 관찰을위한 간단하고 효과적인 galvanotaxis 분석을 만들기위한 우리 연구실의 기술을 설명합니다. 이 분석은 유전자 변형이나 한방 마우스, 짧은 간섭 RNA, 또는 특정 수용체​​ agonists / antagonists의 사용을 통해 세포 운동성에 dcEF의 도입을 규제 메커니즘을 조사에 적합한 것입니다.

Protocol

동물 처리에 관련된 모든 절차는 제도적 지침 (프로토콜 안돼. 20009387)에 따라 토론토 동물 관리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 다음과 같은 방법은 해당되는 층류 후드에 무균 도구와 기술을 사용하여 수행해야합니다. 아래의 프로토콜 텍스트에서 구문 "EFH-SFM은"표피 성장 인자, 기초 섬유 아세포 성장 인자와 헤파린과 보충 혈청 무료 미디어를 의미합니다. ?…

Representative Results

동 분석은 250 MV / mm dcEF의 존재에 undifferentiated NPCs는 음극 대한 높은 이동 및 빠른 galvanotaxis (그림 5A, 영화 1) 전시 것을 보여줍니다. dcEF의 부재에서 세포의 무작위 운동 (그림 5B, 영화 2) 관찰된다. 이 필드 강도에서 undifferentiated NPCs의> 98 %가 그들이 이미징하는 동안 전체 6-8 시간에 대한 마이그레이션, 죽은 세포가 마이그레이션되지 않기 때문에이 사람들이 dcEF의 부재 ?…

Discussion

이 프로토콜은 이전 연구 ^7-9의 잘 알려진 방법에서 적응되었습니다. Galvanotactic 챔버는 세포 시딩의 구속, 또는 중앙 트로프 ^10,11의 microfabrication에 대한 CO ₂ 레이저 절제를 사용하는 잘 별도의 유리의 건설 등 다양한 기법, 다양한을 사용하여 구성 할 수 있습니다. 일부 기술은 다른 것보다 더 힘든거나 비용이 많이 드는 될 수 있습니다. 우리는 일반적으로 대부분의 세포 생…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.