Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Summary

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Abstract

De ontdekking van neurale stamcellen en progenitorcellen (gezamenlijk aangeduid neurale voorlopercellen) (NPC) in de volwassen hersenen van zoogdieren heeft geleid tot een hoeveelheid onderzoek gericht op het gebruik multipotente en proliferatieve eigenschappen van deze cellen voor de ontwikkeling van strategieën neuroregeneratieve. Een kritische stap voor het succes van deze strategieën is de mobilisatie van NPCs naar een laesie na transplantatie exogene of de reactie van de endogene precursors die worden gevonden in de periventriculaire gebied van de CNS verbeteren. Derhalve is het essentieel om de mechanismen bevordering, leiden en verbeteren NPC migratie. Ons werk richt zich op het gebruik van gelijkstroom elektrische velden (dcEFs) het bevorderen en directe NPC migratie – een fenomeen dat bekend staat als galvanotaxis. Endogene fysiologische elektrische velden functioneren als kritische aanwijzingen voor celmigratie tijdens de normale ontwikkeling en wondheling. Farmacologische verstoring van detrans-neurale buis potentieel in axolotl embryo's veroorzaakt ernstige ontwikkelingsstoornissen afwijkingen ^1. In de context van wondheling, is de snelheid van herstel van verwonde hoornvlies direct gecorreleerd met de grootte van de wond epitheliale potentieel dat ontstaat na verwonding, zoals blijkt uit farmacologische versterking of verstoring van dit dcEF ^2-3. We toonden aan dat volwassen subependymale NPCs snel en gericht kathodische migratie ondergaan in vitro bij blootstelling aan een extern aangebracht dcEF. In dit protocol beschrijven we ons lab de technieken voor het creëren van een eenvoudige en effectieve galvanotaxis test voor hoge resolutie lange termijn observatie van gericht cellichaam translocatie (migratie) op een single-cell niveau. Deze test zou geschikt zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die in cellulaire transductie dcEF motiliteit reguleren door het gebruik van transgene of knock-out muizen, korte interfererende RNA, of specifieke receptor agonisten / antagonisten.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren behandeling werden goedgekeurd door de Universiteit van Toronto Animal Care Comite in overeenstemming met de institutionele richtlijnen (protocol nr. 20009387). De volgende methoden worden uitgevoerd met steriele instrumenten en technieken, in een laminaire stroming kap indien van toepassing. In het protocol onderstaande tekst de uitdrukking "EFH-SFM" verwijst naar serumvrij medium, aangevuld met epidermale groeifactor, basische fibroblast groeifactor…

Representative Results

Kinematische analyse blijkt dat in de aanwezigheid van een 250 mV / mm dcEF, ongedifferentieerde NPCs zeer gericht en snelle galvanotaxis naar de kathode (Figuur 5A, Movie 1) vertonen. In afwezigheid van een dcEF wordt willekeurige beweging van de cellen waargenomen (Figuur 5B, Movie 2). Dit veldsterkte> 98% van ongedifferentieerde NPCs migreren voor de gehele 6-8 hr waarvoor zij worden afgebeeld, en aangezien er dode cellen migreren niet suggereert dat zij levensvatbaar blijven gedu…

Discussion

Dit protocol is aangepast van de reeds lang gevestigde methoden van eerdere studies ^7-9. Galvanotactic kamers kunnen worden geconstrueerd met een verscheidenheid van verschillende technieken, waaronder de bouw van een aparte glazen goed voor opsluiting van cel zaaien of met CO ₂ laser ablatie voor microfabricage van de centrale trog ^10,11. Sommige technieken kunnen omslachtiger of duurder dan andere. Wij hebben er een eenvoudige en kosteneffectieve test voor de bouw van een NPC galvanota…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.