En Galvanotaxis Assay for Analyse af neurale Prækursormaterialer cellemigration Kinetics i en eksternt påført Direct Current Electric Field

Summary

I denne protokol vi vise hvordan man opfører brugerdefinerede kamre, der tillader anvendelsen af ​​en jævnstrøm elektrisk felt for at aktivere time-lapse imaging af voksen hjerne afledt neural precursorcelletype translokation under galvanotaxis.

Abstract

Opdagelsen af ​​neurale stam-og progenitorceller (samlet betegnet neurale precursorceller) (NPC) i den voksne pattedyrhjernen har ført til en omfattende forskning med henblik på at udnytte de multipotente og proliferative egenskaber af disse celler til udvikling af neuroregenerative strategier. Et afgørende skridt for en vellykket gennemførelse af sådanne strategier er mobilisering af NPCs mod en læsion site efter exogent transplantation eller at øge svar af de endogene prækursorer, der findes i periventricular region af CNS. Derfor er det vigtigt at forstå de mekanismer, der fremmer, vejlede og forbedre NPC migration. Vores arbejde fokuserer på udnyttelse af jævnstrøms elektriske felter (dcEFs) at fremme og direkte NPC migration – et fænomen kendt som galvanotaxis. Endogene fysiologiske elektriske felter fungerer som kritiske signaler for cellemigrering under normal udvikling og sårheling. Farmakologisk afbrydelse aftrans-neuralrøret potentiale i Axolotl embryoner forårsager alvorlige udviklingsmæssige misdannelser ^1. I forbindelse med sårheling, er hastigheden for reparation af sårede hornhinde direkte korreleret med størrelsen af den epitel sår potentiale, der opstår efter beskadigelse, som det fremgår af farmakologisk forøgelse eller afbrydelse af denne dcEF ^2-3. Vi har vist, at voksne subependymale NPCs undergår hurtig og rettet katodisk migration in vitro, når de udsættes for et eksternt påført dcEF. I denne protokol beskriver vi vores laboratorium har teknikker til at skabe en enkel og effektiv galvanotaxis assay for høj opløsning, langvarig observation af direkte cellelegemet translokation (migration) på en enkelt-celle niveau. Dette assay ville være egnet til at undersøge de mekanismer, der regulerer dcEF transduktion ind cellulære motilitet ved anvendelse af transgene eller knockout-mus, korte interfererende RNA eller specifikke receptor-agonister / antagonister.

Protocol

Alle procedurer, der involverer håndtering af dyr blev godkendt af University of Toronto Animal Care udvalg i overensstemmelse med de institutionelle retningslinjer (protokol nr. 20.009.387). Følgende metoder bør udføres med sterile redskaber og teknikker, i en laminar strømningshætte givet fald. I protokollen teksten nedenfor, henviser udtrykket "EFH-SFM" til serumfrit medium suppleret med epidermal vækstfaktor, basisk fibroblastvækstfaktor og heparin. EFH-SFM bruges, når…

Representative Results

Kinematisk analyse viser, at i nærværelse af et 250 mV / mm dcEF, udifferentierede NPCs udviser stærkt rettet og hurtig galvanotaxis mod katoden (figur 5A, Movie 1). I mangel af en dcEF, er tilfældige bevægelse af cellerne observeret (fig. 5B, Movie 2). På dette feltstyrke, migrerer> 98% af udifferentierede NPCs for hele 6-8 timer, som de er afbildet, og da døde celler ikke migrerer dette tyder på, at de forbliver levedygtige i denne periode i fravær eller nærvær af en dcE…

Discussion

Denne protokol er blevet tilpasset fra de veletablerede metoder til tidligere undersøgelser ^7-9. Galvanotactic kamre kan konstrueres ved anvendelse af en række forskellige teknikker, herunder konstruktionen af et separat glas godt for indespærring af cellepodning, eller ved hjælp af CO _2-laser ablation til mikrofabrikation af den centrale trug ^10,11. Nogle teknikker kan være mere arbejdskrævende eller dyre end andre. Vi har beskrevet en enkel og omkostningseffektiv analyse for at k…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.