En Galvanotaxis Assay for analyse av Neural forløper celle migrasjon Kinetics i en eksternt anvendes Direct Current elektrisk felt

Summary

I denne protokollen viser vi hvordan du kan lage tilpassede kammer som tillater bruk av en likestrøm elektrisk felt for å aktivere time-lapse avbildning av voksen hjerne avledet nevrale forløper celle translokasjon under galvanotaxis.

Abstract

Oppdagelsen av nevrale stilk og progenitor celler (betegnet med samlebetegnelsen neural forløper celler) (NPC) i den voksne hjernen hos pattedyr har ført til en kropp av forskning rettet mot å utnytte de multipotent og proliferativ egenskapene til disse cellene for utvikling av neuroregenerative strategier. En kritisk steg for å lykkes med slike strategier er mobilisering av NPCer mot en lesjon nettstedet etter eksogene transplantasjon eller for å forbedre responsen til de endogene forløperne som er funnet i den periventrikulær regionen i CNS. Følgelig er det viktig å forstå hvilke mekanismer som fremmer, veilede og forbedre NPC migrasjon. Vårt arbeid fokuserer på utnyttelse av likestrøm elektriske felt (dcEFs) for å fremme og direkte NPC migrasjon – et fenomen kjent som galvanotaxis. Endogene fysiologiske elektriske felt fungere som kritiske signaler for celle migrasjon under normal utvikling og såret reparasjon. Farmakologisk forstyrrelse avtrans-nevralrøret potensial i Axolotl embryoer forårsaker alvorlige utviklingsforstyrrelser misdannelser ^en. I sammenheng med sårtilheling, er frekvensen av reparasjon av sårede hornhinnen direkte korrelert med størrelsen av epiteliale såret potensialet som oppstår etter skaden, som vist ved farmakologisk forsterkning eller avbrudd av denne DCEF ^2-3. Vi har vist at voksne subependymal NPCer gjennomgå rask og regissert katodisk migrasjon in vitro når de utsettes for en eksternt påført DCEF. I denne protokollen beskriver vi vår lab teknikker for å skape en enkel og effektiv galvanotaxis analysen for høy oppløsning, langsiktige observasjon av rettet cellen kroppen translokasjon (migrasjon) på en encellet nivå. Denne analysen vil være egnet for å undersøke mekanismer som regulerer DCEF transduksjon i cellulært motilitet gjennom bruk av transgene eller knockout mus, korte interfererende RNA, eller bestemte reseptor agonister / antagonister.

Protocol

Alle prosedyrer som involverer dyr håndtering ble godkjent av Universitetet i Toronto Animal Care komiteen i samsvar med institusjonelle retningslinjer (protokoll nr. 20009387). Følgende metoder bør utføres ved hjelp av sterile verktøy og teknikker, i en laminær hette der det er aktuelt. I protokollen teksten nedenfor, refererer uttrykket "EFH-SFM" til serumfritt medier supplert med epidermal vekstfaktor, grunnleggende fibroblast vekstfaktor og heparin. EFH-SFM brukes når et…

Representative Results

Kinematisk analyse viser at i nærvær av en 250 mV / mm DCEF, udifferensierte NPCer oppviser sterkt rettet og raske galvanotaxis mot katoden (figur 5A, Film 1). I fravær av en DCEF, er tilfeldig bevegelse av cellene observert (figur 5B, Film 2). På dette feltstyrke,> 98% av udifferensierte NPCer migrerer for hele 6-8 hr som de er avbildet, og siden døde celler ikke migrere dette tyder på at de forblir levedyktig i denne perioden i fravær eller nærvær av en DCEF. <p class=…

Discussion

Denne protokollen har blitt tilpasset fra de veletablerte metoder for tidligere studier ^7-9. Galvanotactic kamre kan konstrueres ved hjelp av en rekke forskjellige teknikker, herunder konstruksjonen av en separat glass godt for innesperring av celle såing, eller ved hjelp av CO ₂ laser ablasjon for microfabrication av den sentrale renne ^10,11. Noen teknikker kan være mer arbeidskrevende eller kostbare enn andre. Vi har beskrevet en enkel og kostnadseffektiv analyse for å konstruere en…

Materials

Name of item	Company	Catalogue number	Comments
			Neural Precursor Cell Isolation
2M NaCl	Sigma	S5886	11.688 g dissolved in 100 ml dH2O
1M KCl	Sigma	P5405	7.456 g dissolved in 100 ml dH2O
1M MgCl2	Sigma	M2393	20.33 g dissolved in 100 ml dH2O
155 mM NaHCO3	Sigma	S5761	1.302 g dissolved in 100 ml dH2O
0.5M Glucose	Sigma	G6152	9.01 g dissolved in 100 ml dH2O
108 mM CaCl2	Sigma	C7902	1.59 g dissolved in 100 ml dH2O
Penicillin-streptomycin	Gibco	15070
Bovine pancreas trypsin	Sigma	T1005
Sheep testes hyaluronidase	Sigma	H6254
Kynurenic acid	Sigma	K3375
Ovomucoid trypsin inhibitor	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% Glucose	Sigma	G6152
7.5% NaHCO3	Sigma	S5761
1M HEPES	Sigma	H3375	23.83 g dissolved in 100 ml dH2O
L-glutamine	Gibco	25030
EGF	Invitrogen	PMG8041	Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units.
Heparin	Sigma	H3149
Apo-transferrin	R&D Systems	3188-AT	0.1 g dissolved into 4 ml dH20
Putrescine	Sigma	P7505	Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution
Insulin	Sigma	I5500	Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20
Selenium	Sigma	S9133
Progesterone	Sigma	P6149
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Dissection microscope	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis Chamber Preparation
Square glass cover slides	VWR	16004
6N Hydrochloric Acid	VWR	BDH3204-1
High vacuum grease	Dow Corning
60 mm Petri dishes	Fisher Scientific	0875713A
Poly-L-lysine	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Thaw and aliquot into 150 μl units
FBS	Invitrogen	10082139	Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above
Counting microscope	Olympus	CKX41
			Live Cell Time-Lapse Imaging
Silver wire	Alfa Aesar	11434
UltraPure Agarose	Invitrogen	15510-027
Heat Inactivated FBS	Sigma	16140071
PVC tubing	Fisher Scientific	80000006	3/32″ID x 5/32″OD
Bleach	Clorox
10 cc syringe	BD	309604
18 gauge needle	BD	305195
Dremel drill	Dremel	Model 750
Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber	Zeiss	Axiovert-200M
			Recipes Item Volume 2M NaCl 6.2 ml 1M KCl 0.5 ml 1M MgCl2 0.32 ml 155mM NaHCO3 16.9 ml 1M Glucose 1 ml 108 mM CaCl2 0.09256 ml Penicillin-streptomycin 1 ml Autoclaved water 74 ml Artificial cerebrospinal fluid Item Volume or Mass Artificial cerebrospinal fluid 30 ml Bovine pancreas trypsin 40 mg Sheep testes hyaluronidase 22.8 mg Kynurenic acid 5 mg Trypsin Solution Item Volume or Mass SFM 15 ml Ovomucoid trypsin inhibitor 10 mg Trypsin Inhibitor Solution Item Volume Autoclaved water 37 ml 10X DMEM/F12 10 ml 30% Glucose 2 ml 7.5% NaHCO3 1.5 ml 1M HEPES 0.5 ml Transferrin, Putrescine solution 4 ml 25 mg insulin solution 4 ml Selenium 100 μl Progesterone 100 μl Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C) Item Volume Autoclaved water 37.5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% Glucose 1 ml 7.5% NaHCO3 0.75 ml 1M HEPES 0.25 ml Hormone mix 5 ml L-glutamine 0.5 ml Penicillin-streptomycin 0.5 ml Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS Item Volume Matrigel 150 μl SFM 3.6 ml Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration. Item Volume or Mass UltraPure Agarose 300 mg in 10 ml ddH20 SFM Heat Inactivated FBS 8 ml 2 ml Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath.