تدفق الخلوي على أساس تنقية<em> S. خميرة</em> بيضات ملقحة
Summary
لتنقية بيضات ملقحة من<em> S. خميرة</em>، كانت قد صممت الخلايا فرداني نوع التزاوج المعاكس للتعبير عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء، وشارك في المحتضنة للسماح تشكيل لاقحة، ومجزأة باستخدام تدفق الخلوي على أساس البروتوكول. الكسر عالي التخصيب يمكن اللاحقة "-OMIC" دراسات والانتعاش الأولي من ذرية، والتحقيق المنهجي لاقحة التشكل.
Abstract
بيضات ملقحة هي وسيطة بين فرداني الأساسية والدول مضاعفا في دورة حياة العديد من الكائنات الحية، بما في ذلك الخميرة (الشكل 1) 1. S. خميرة بيضات ملقحة تنتج عن دمج خلايا من نوع فرداني التزاوج متميزة (ماتا، MATalpha) وتؤدي إلى diploids مستقرة المقابلة التي تولد تباعا ما يصل إلى 20 سلالة مضاعفا نتيجة لانقساماتهم الإنقسامية غير المتماثلة لافت للنظر 2. ودبرت تشكيل البيضة الملقحة عن طريق سلسلة معقدة من الأحداث: في هذه العملية، والعوامل القابلة للذوبان التزاوج ربط المستقبلات المشابهة، مما اثار مستقبلات بوساطة أجهزة الطرد المركزي التي تسهل إشارة توقف دورة الخلية وتبلغ ذروتها في الخلية خلية الانصهار. ويمكن اعتبار بيضات ملقحة نموذجا للسلف أو وظيفة خلايا الجذعية.
على الرغم من أن تم تعلمه الكثير عن تشكيل بيضات ملقحة وعلى الرغم من استخدام بيضات ملقحة للتحقيق في الخلية الجزيئية مسائل signif العامicance، تقريبا جعلت جميع الدراسات استخدام الخلائط التزاوج الذي يتم مختلط بيضات ملقحة التي تتألف غالبية سكانها من الخلايا فرداني 3-8. كثير من جوانب الكيمياء الحيوية من تشكيل البيضة الملقحة والحياة المستمرة لاقحة تبقى دون تحقيق ذلك.
تقارير تنقية بيضات ملقحة الخميرة وصف بروتوكولات يعتمد على خصائص الترسيب على 9؛ إلا أن هذا الإجراء يستند إلى الترسيب لم تسفر عن ما يقرب من 90٪ النقاء في أيدينا. وعلاوة على ذلك، فإنه لديه عيب وتتعرض الخلايا لالسوربيتول مفرط التوتر. ولذلك وضعت إجراء تنقية تنوعا. لهذا الغرض، وكان أزواج من الخلايا فرداني معربا عن البروتينات الفلورية الخضراء أو الحمراء شارك في المحتضنة للسماح تشكيل لاقحة، تحصد في أوقات مختلفة، وعلى بيضات ملقحة وتنقيته مما أدى باستخدام بروتوكول تدفق الخلوي على أساس الفرز. هذه التقنية يوفر تقييم مريحة البصرية من النقاء والنضج. نقاء المتوسطمن الكسر ما يقرب من 90٪. وفقا لتوقيت الحصاد، يمكن استرداد بيضات ملقحة من درجات متفاوتة من النضج. العينات النقية توفير نقطة انطلاق لمريحة "، OMIC" دراسات، لاسترداد ذرية الأولية، وللتحقيق المنتظم لهذه الخلية السلف.
Protocol
Discussion
توافر بيضات ملقحة تنقية ينبغي أن تيسر الدراسات البيوكيميائية بما في ذلك البروتيوميات، وtranscriptomics lipidomics، وكذلك التحقيق في الآليات التي تخضع لدورة الخلية بيضات ملقحة إعادة الدخول، إعادة عرض الحائط الخلية، والخصائص الناشئة والميراث، وما إلى ذلك وبدلا من ذلك، يمكن إنش?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور مايكل R. Sramkoski للمساعدة في التدفق الخلوي، والدكتور والدكتور جايسوال بورنيما وو دي لفي وقت سابق المدخلات وAylyarov ايليا للحصول على مساعدة مع الرسوم التوضيحية. بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح R01GM089872 والخلوي ومرفق التصوير الأساسية المجهر المركز الشامل للسرطان حالة (P30 CA43703).
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. . Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. . Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
