のフローサイトメトリーベースの精製<em> S.セレビ</em>受精卵
Summary
の受精卵を精製するために<em> S.セレビ</em>、反対の交配型の半数体細胞をフローサイトメトリーベースのプロトコルを使用して接合体形成を可能にするために共インキュベート、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するように操作し、分画した。高濃縮画分は初期の子孫のその後 "-OMIC"研究、リカバリ、および受精卵形態形成の体系的な調査が可能になります。
Abstract
受精卵は、酵母（ 図1）1 を含む多くの生物のライフサイクルにおける半数体と二倍体の状態の間の本質的な中間体である。S. cerevisiaeは異なる交配型（マタ、MATalpha）の半数体細胞の融合の結果を受精卵と相次い著しく非対称な有糸分裂2の結果と同様に多くの20倍体子孫を生成し、対応する安定した二倍体を生じさせる。接合子形成はイベントの複雑なシーケンスによって調整されます：このプロセスでは、可溶性交配因子が受容体を同族に結合し、細胞と細胞の融合細胞周期と絶頂に達するの中断を促進するレセプター媒介性シグナル伝達カスケードをトリガする。受精卵は、前駆細胞または幹細胞機能のモデルと考えられるかもしれません。
多くの受精卵の形成について学習されていないが、受精卵は一般signifの細胞分子質問を調査するために使用されているもののicanceは、ほとんどすべての研究は、受精卵が3月8日ハプロイド細胞の大多数の人口と混在されている交配混合物を利用してきました。接合子形成と接合子の継続生命の生化学の多くの側面は、したがって、未調査のままである。
酵母の接合体の浄化のレポートでは、沈降特性9に基づいてプロトコルを記述しますが、この沈降ベースの手順は私たちの手の中に約90％の純度が得られなかった。また、細胞は高張ソルビトールにさらされているという欠点を有している。そこで我々は、汎用性の高い精製法を開発しました。この目的のために、赤色または緑色蛍光タンパク質を発現するハプロイド細胞のペアは、接合体形成、様々な時期に収穫し、得られた受精卵は、フローサイトメトリーベースのソートプロトコルを用いて精製したを可能にするために共同でインキュベートした。この手法は、純粋さと成熟の便利な視覚的評価を提供します。平均純度画分の約90％である。収穫のタイミングに応じて、成熟度の異なる受精卵を回収することができる。精製されたサンプルは、 "-OMIC"研究のために、初期の子孫の回復のため、この前駆細胞の系統的な調査のための便利な出発点を提供しています。
Protocol
Discussion
精製された受精卵の可用性は、別の方法として、受精卵が出発生成される可能性がトランスクリプトミクス、プロテオミクス、リピドミクス、並びに受精卵が細胞周期の再入国、細胞壁のリモデリング、出芽と継承の特性を受ける際のメカニズムの調査を含む生化学的研究等を促進しなければならない一方または両方の両親に特性変異を有する菌株による。また、精製された受精卵は、半数?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、イラスト付きのヘルプは以前の入力とイリヤAylyarovためのフローサイトメトリー、博士誕祭JaiswalさんとDrディウーのヘルプは博士R.マイケルSramkoskiに感謝します。 NIHグラントR01GM089872とメトリー＆ケース総合がんセンター（P30 CA43703）のイメージング顕微鏡の中核施設でサポートされている。
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. . Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. . Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
