Flowcytometri-baseret oprensning af<em> S. cerevisiae</em> Zygoter
Summary
For at oprense zygoter af<em> S. cerevisiae</em>, Blev haploide celler af modsat parringstype manipuleret til at udtrykke rødt eller grønt fluorescerende proteiner, co-inkuberede at tillade zygote formation og fraktioneret under anvendelse af en flow-cytometri-baseret protokol. Det stærkt fraktion muliggør efterfølgende "-miske" undersøgelser, inddrivelse af initial afkom, og systematisk undersøgelse af zygote morfogenese.
Abstract
Zygoter er vigtige mellemprodukter mellem haploide og diploide stater i livscyklus mange organismer, herunder gær (figur 1) 1. S. cerevisiae zygoter resultat af fusion af haploide celler af forskellig parringstype (MATa, MATalpha) og give anledning til tilsvarende stabile diploider, der successivt genererer så mange som 20 diploid afkom som følge af deres påfaldende asymmetriske mitotiske afsnit 2. Zygote formation organiseret af en kompleks sekvens af begivenheder: I denne proces binder opløselige hinanden passende faktorer til beslægtede receptorer, udløser receptormedierede signaleringskaskader, der letter afbrydelse af cellecyklussen og de samles i celle-cellefusion. Zygoter kan betragtes som en model for stamcelle eller stamcelle-funktion.
Selv om meget er blevet lært om dannelsen af zygoter og selvom zygoter er blevet anvendt til at undersøge celle-molekylære spørgsmål af generel betyicance, næsten alle studier har gjort brug af samvirkende blandinger, hvori zygoter er blandet med et flertal population af haploide celler 3-8. Mange aspekter af biokemi af zygote dannelse og den fortsatte liv i det befrugtede æg derfor fortsat ikke undersøgt.
Rapporter om oprensning af gær zygoter beskriver protokoller baseret på deres sedimentation egenskaber 9; dog dette sedimentation-baserede procedure ikke giver næsten 90% renhed i vores hænder. Desuden har den den ulempe, at celler udsættes for hypertonic sorbitol. Vi har derfor udviklet en alsidig oprensningsprocedure. Til dette formål blev par af haploide celler, der udtrykker røde eller grønne fluorescerende proteiner co-inkuberes for at tillade zygote formation, høstet på forskellige tidspunkter, og de resulterende zygoter blev oprenset under anvendelse af en flow-cytometri-baseret sortering protokol. Denne teknik giver en bekvem visuel vurdering af renhed og modning. Den gennemsnitlige renhedsgradaf fraktionen er omkring 90%. Ifølge timingen af høsten, kan zygoter af varierende grader af modenhed skal tilbagebetales. De oprensede prøver giver et bekvemt udgangspunkt for "-miske" undersøgelser, til inddrivelse af initial afkom, og for systematisk undersøgelse af denne progenitorcelle.
Protocol
Discussion
Tilgængeligheden af oprensede zygoter bør lette biokemiske undersøgelser, herunder transcriptomics, proteomics og lipidomics samt undersøgelse af mekanismer, hvorved zygoter undergår cellecyklus genindrejse, cellevæg remodeling, spirende og arv egenskaber, etc. Alternativt kunne zygoter blive genereret start med stammer, der bærer karakteristiske mutationer i en eller begge forældre. Endvidere er de oprensede zygoter, som for haploide eller diploide celler, kan fryses i medium indeholdende 15% glycerol og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. R. Michael Sramkoski for hjælp med flowcytometri, Dr. Purnima Jaiswal og Dr. Di Wu for tidligere input og Ilya Aylyarov om hjælp med illustrationerne. Støttet af NIH Grant R01GM089872 og Cytometry & Imaging Microscopy Core Facility for Case Comprehensive Cancer Center (P30 CA43703).
Materials
| Reagent/Equipment | Source | Catalogue Number |
| pEG220, URA3/YIp, encoding cytoplasmic GFP 11) | E. Grote | |
| pAJ1661, URA3/CEN, encoding RPL25 fused to mCherry | A. Johnston | |
| Fisher FB120 sonicator | Fisher Scientific | |
| Polypropylene tube with strainer cap | BD Falcon | Ref 352235 |
| Refrigerated microfuge | Tomy | MRX-150 |
| Flow cytometry sheath solution | Biosure | 1027 |
| iCyt Reflection Model Flow Cytometer | Sony | |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision | |
| Upright epifluorescence microscope | Leica | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-07 |
| CSM glucose formulation Notes: For agar plates, simply include 2% agar (Difco) |
10 |
References
- Herskowitz, I., Oshima, Y. . Control of cell type in Saccharomyces cerevisiae: Mating type and mating-type interconversion. , 181-210 (1981).
- Muller, I. Parental age and the life-span of zygotes of Saccharomyces cerevisiae. Antonie Van Leeuwenhoek. 51, 1-10 (1985).
- Tartakoff, A. M., Jaiswal, P. Nuclear fusion and genome encounter during yeast zygote formation. Mol. Biol. Cell. 20, 2932-2942 (2009).
- Azpiroz, R., Butow, R. A. Patterns of mitochondrial sorting in yeast zygotes. Mol. Biol. Cell. 4, 21-36 (1993).
- Rose, M. D. Nuclear fusion in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 663-695 (1996).
- Dujon, B., Jones, E., Strathern, J., Broach, J. . Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance. , 505-635 (1981).
- Sprague, G. F. Assay of yeast mating reaction. Methods Enzymol. 194, 77-93 (1991).
- Ydenberg, C. A., Rose, M. D. Yeast mating: a model system for studying cell and nuclear fusion. Methods Mol. Biol. 475, 3-20 (2008).
- Sena, E. P., Radin, D. N., Fogel, S. Synchronous mating in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 1373-1377 (1973).
- Amberg, D., Burke, D., Strathern, D. . Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, 2005 Edition. , (2005).
- Nolan, S., Cowan, A. E., Koppel, D. E., Jin, H., Grote, E. FUS1 regulates the opening and expansion of fusion pores between mating yeast. Mol. Biol. Cell. 17, 2439-2450 (2006).
- Weisman, L. S. Organelles on the move: insights from yeast vacuole inheritance. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 243-252 (2006).
