Rensing og aggregeringen av amyloid forløperprotein intracellulære domenet
Summary
Fremgangsmåte for storskala rensing av APP intracellulære domenet (AICD) er beskrevet. Vi beskriver også metodikk for å indusere<em> In vitro</em> AICD aggregering og visualisering av atomic force mikroskopi. Fremgangsmåtene beskrevet er nyttige for biokjemiske / strukturell karakterisering av AICD og virkninger av molekylære anstand for aggregering sin.
Abstract
Amyloid forløper protein (APP) er en type I transmembrane protein forbundet med patogenesen av Alzheimers sykdom (AD). APP er preget av en stor ekstracellulære domene og en kort cytosoliske domene kalt APP intracellulære domenet (AICD). Under modning gjennom den sekretoriske vei kan APP spaltes av proteaser betegnet α, β og γ-secretases 1. Sekvensiell proteolytisk spaltning av APP med β og γ-secretases fører til fremstilling av en liten proteolytisk peptid, betegnet Aβ, som er amyloidogenic og kjernen bestanddelen av senile plakk. Den AICD er også frigjort fra membranen etter secretase behandling, og gjennom samhandling med Fe65 og Tip60 kan translocate til kjernen til å delta i transkripsjon regulering av flere målgener 2,3. Protein-protein interaksjoner som involverer AICD kan påvirke menneskehandel, behandling og cellulære funksjoner av holo-APP og C-terminal fragmenter. Vi har nylig vist at AICD kan aggregere i vitro, og denne prosessen er hemmet av AD-innblandet molekylær anstand ubiquilin-1 4. Samsvar med disse funnene, har AICD utsatt hydrofobe domener, og er egentlig uordnede in vitro 5,6, men det får stabil sekundær struktur når bundet til Fe65 7. Vi har foreslått at ubiquilin-1 hindrer upassende Inter-og intramolekylær interaksjoner av AICD, hindrer aggregering in vitro og in intakte celler 4. Mens de fleste studier fokuserer på den rollen APP i patogenesen av AD, er rollen AICD i denne prosessen ikke klart. Ekspresjon av AICD har vist seg å indusere apoptose 8, å modulere signalveier 9, og for å regulere kalsium signalisering 10. Over-uttrykk for AICD og Fe65 i en transgen mus modell induserer Alzheimers som patologi 11, og nylig AICD er påvist i BHi lysates av vestlige blotting ved bruk egnede antigen henting teknikker 12. Å lette strukturelle, biokjemiske og biofysiske studier av AICD, har vi utviklet en prosedyre for å produsere rekombinant store mengder av meget rent AICD protein. Vi videre beskrive en fremgangsmåte for å indusere in vitro aggregering av termiske AICD og analyse ved atomic force mikroskopi. Fremgangsmåtene beskrevet er nyttige for biokjemisk, biofysiske og strukturell karakterisering av AICD og virkninger av molekylære anstand for AICD aggregering.
Protocol
Discussion
I denne protokollen har vi skissert en prosedyre for å oppnå svært ren AICD for strukturelle, biofysiske og biokjemiske analyser. Denne fremgangsmåten krever ikke avansert kromatografi utstyr og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier. Andre grupper har renset AICD 5-7,16, inkludert GST-AICD 17-19, for biokjemiske / strukturelle analyser. Ulemper til tidligere protokoller er dårlig løselighet av AICD 16, mindre enn ideelle renhet 17, og kravet til størrelsen e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke dr. Hui Zheng (Baylor College of Medicine) for APP cDNA. Dette arbeidet ble finansiert av NIH tilskudd R21AG031948 (DB, JMB), F30AG030878 (ESS), R01DK073394 (AFO), John Sealy Memorial Endowment Fund for Biomedical Research (AFO) og Jean C. og William D. Willis Neuroscience Research Endowment (ESS). JMB er en lærd i translasjonsforskning Scholar Program og medlem av University of Texas Medical Branch Claude E. Pepper Eldre amerikanere Independence Center (støttet av NIH Grants UL1RR029876 og P30-AG-024 832, henholdsvis).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| pGEX-4T-1 | GE Healthcare | 28-9545-49 | |
| Thrombin | GE Healthcare | 27-0846-01 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Bradford protein assay reagent | Bio-Rad | 500-0002 | |
| Coomassie blue | Bio-Rad | 161-0786 | |
| IPTG ( isopropyl-beta-D thiogalactopyranoside) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Glutathione-agarose | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| p-aminobenzamidine-agarose | Sigma-Aldrich | A7155 | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Slide-A-Lyzer dialysis cassettes | Thermo Scientific | 66380 | |
| Chromatography columns | Evergreen Scientific | 208-3367-050 | |
| Emulsifier | Avestin, Inc | EmulsiFlex-C3 | Highly recommended |
| Eppendorf Thermomixer | Eppendorf | 022670107 | |
| Mica Disks | Ted Pella | 50-12 | |
| AFM cantilevers | Bruker | MSNL-10 | |
| WSxM software | Nanotec | N/A | Free download |
References
- De Strooper, B., Vassar, R., Golde, T. The secretases: enzymes with therapeutic potential in Alzheimer disease. Nature reviews. Neurology. 6, 99-107 (2010).
- Chang, K. A., Suh, Y. H. Possible roles of amyloid intracellular domain of amyloid precursor protein. BMB reports. 43, 656-663 (2010).
- McLoughlin, D. M., Miller, C. C. The FE65 proteins and Alzheimer’s disease. J. Neurosci. Res. 86, 744-754 (2008).
- Stieren, E. S. Ubiquilin-1 is a molecular chaperone for the amyloid precursor protein. J. Biol. Chem. 286, 35689-35698 (2011).
- Ramelot, T. A., Nicholson, L. K. Phosphorylation-induced structural changes in the amyloid precursor protein cytoplasmic tail detected by NMR. J. Mol. Biol. 307, 871-884 (2001).
- Ramelot, T. A., Gentile, L. N. Transient structure of the amyloid precursor protein cytoplasmic tail indicates preordering of structure for binding to cytosolic factors. Biochem. 39, 2714-2725 (2000).
- Radzimanowski, J. Structure of the intracellular domain of the amyloid precursor protein in complex with Fe65-PTB2. EMBO Rep. 9, 1134-1140 (2008).
- Ohkawara, T., Nagase, H., Koh, C. S., Nakayama, K. The amyloid precursor protein intracellular domain alters gene expression and induces neuron-specific apoptosis. Gene. 475, 1-9 (2011).
- von Rotz, R. C. The APP intracellular domain forms nuclear multiprotein complexes and regulates the transcription of its own precursor. J. Cell Sci. 117, 4435-4448 (2004).
- Hamid, R. Amyloid precursor protein intracellular domain modulates cellular calcium homeostasis and ATP content. J. Neurochem. 102, 1264-1275 (2007).
- Ghosal, K., Stathopoulos, A., Pimplikar, S. W. APP intracellular domain impairs adult neurogenesis in transgenic mice by inducing neuroinflammation. PLoS ONE. 5, e11866 (2010).
- Pimplikar, S. W., Suryanarayana, A. Detection of APP intracellular domain in brain tissue. Met. Molecul. Biol. 670, 85-91 (2011).
- Buchner, J., Grallert, H., Jakob, U. Analysis of chaperone function using citrate synthase as nonnative substrate protein. Met. Enzymol. 290, 323-338 (1998).
- Hansma, H. G. Recent advances in atomic force microscopy of DNA. Scanning. 15, 296-299 (1993).
- Valbuena, A. Quasi-simultaneous imaging/pulling analysis of single polyprotein molecules by atomic force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 78, 113707 (2007).
- Radzimanowski, J., Beyreuther, K., Sinning, I., Wild, K. Overproduction, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of human Fe65-PTB2 in complex with the amyloid precursor protein intracellular domain. Acta Crystallogr. Sect. F Struct. Biol. Cryst. Commun. 64, 409-412 (2008).
- Chen, T. Y., Liu, P. H., Ruan, C. T., Chiu, L., Kung, F. L. The intracellular domain of amyloid precursor protein interacts with flotillin-1, a lipid raft protein. Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 266-272 (2006).
- Kim, M. Y. Regulation of Notch1 signaling by the APP intracellular domain facilitates degradation of the Notch1 intracellular domain and RBP-Jk. J. Cell Sci. 124, 1831-1843 (2011).
- Lazarov, O. Axonal transport, amyloid precursor protein, kinesin-1, and the processing apparatus: revisited. J. Neurosci. 25, 2386-2395 (2005).
- Kakuda, N. Equimolar production of amyloid beta-protein and amyloid precursor protein intracellular domain from beta-carboxyl-terminal fragment by gamma-secretase. J Biol. Chem. 281, 14776-14786 (2006).
- Gosal, W. S., Myers, S. L., Radford, S. E., Thomson, N. H. Amyloid under the atomic force microscope. Protein Pept. Lett. 13, 261-270 (2006).
