تصور الردود السم البكتيري المستحثة عن طريق لايف مضان المجهري الخليوي

Summary

طرق لتنقية الكولسترول ملزمة السم ستربتوليزين O من المؤتلف<em> E. القولونية</emموصوفة> والتصور من السم ملزمة للعيش الخلايا حقيقية النواة. تسليم المترجمة من السم يؤدي الى تغييرات سريعة ومعقدة في الخلايا المستهدفة يكشف جوانب جديدة من الأحياء السم.

Abstract

السموم البكتيرية ربط الكوليسترول في الأغشية، وتشكيل المسام التي تسمح لتسرب محتويات الخلوية وتدفق المواد من البيئة الخارجية. يمكن استرداد الخلية إما من هذه الإهانة، الأمر الذي يتطلب عمليات إصلاح غشاء بالموقع، وإلا يموت اعتمادا على كمية التعرض للسموم ونوع من الخلايا ^1. وبالإضافة إلى ذلك، هذه السموم لحث على الاستجابة للالتهابات قوية في المضيفين المصابة من خلال تنشيط خلايا المناعة، بما في ذلك الضامة، والتي تنتج مجموعة واسعة من السيتوكينات الموالية للالتهابات ^2. كثير من البكتيريا إيجابية الجرام تنتج السموم ملزمة الكوليسترول التي ثبت للمساهمة في الفوعة من خلال آليات uncharacterized إلى حد كبير.

التغييرات الشكلية في غشاء البلازما من الخلايا المعرضة لهذه السموم تتضمن تنحية بهم إلى السطح نتوءات الكولسترول عالي التخصيب، والتي يمكن تسليط في الفضاء خارج الخلية مما يدل على أن الدفاع الجوهرية الخلويةآلية ^3،4. هذه العملية تحدث في جميع الخلايا في حالة عدم وجود النشاط الأيضي، ويمكن تصور استخدام EM بعد ⁴ تثبيت الكيميائية. في الخلايا المناعية مثل الخلايا البلعمية التي تتوسط الالتهاب ردا على التعرض للسموم، واقترح الحويصلات الغشاء يسببها لاحتواء السيتوكينات من عائلة IL-1 وربما تكون مسؤولة على حد سواء لسفك السم ونشر هذه السيتوكينات الموالية للالتهابات ^5،6،7. A الرابط بين IL-1β الإفراج ونوع معين من موت الخلايا، وقد اقترح تسميته pyroptosis، وكلاهما العمليات كاسباس-1 تعتمد ^8. لفرز تعقيدات هذا الرد البلاعم، والذي يتضمن ربط السم، متراجعا من الحويصلات الغشاء، وإطلاق سراح خلوى، وموت الخلايا يحتمل، وقد وضعنا أساليب التصنيف وطرق الفحص المجهري مضان التي تسمح لتصور الوقت الحقيقي من السم خلايا التفاعلات، بما في ذلك قياسات ضعف والموت (الشكل 1). استخدمالتصوير الخلية الحية ضروري بسبب قيود في تقنيات أخرى. ويمكن للنهج البيوكيميائية يتم تحليل التأثيرات التي تحدث في الخلايا الفردية، في حين أن التدفق الخلوي لا يقدم عالية الجودة، في الوقت الحقيقي التصور من الخلايا الفردية. ويمكن تطبيق الأساليب المذكورة هنا لتحليل الحركية من الردود الناجمة عن المنبهات الأخرى التي تنطوي على تغييرات في الخلايا المعقدة المظهري.

Protocol

1. تنقية O ستربتوليزين (SLO) تطعيم 20 مل الثقافة بين عشية وضحاها من الخلايا التي تحتوي على BL21 GOLD-pBADgIII SLOhis البلازميد 9 الى 0.5 لتر مرق LB وإضافة 500 ميكرولتر 50 ملغ / مل الأمبيسلين. يهز نحو 225 دورة في الدقيقة الثقافة في C ° 37 حت?…

Representative Results

يمكن عادة 10 7 8 -10 يمكن الحصول عليها U / مل SLO مع تركيز البروتين من 4 ملغ / مل. كمية السم اللازمة لتحلل الخلايا تختلف وفقا لنوع الخلية، ولكن عادة ما يكون 125-500 U / مل SLO (الشكل 2B). يمكن أنواع الخلايا مثل الخلايا البلعمية تكون أكثر مقاومة (4000 U / مل) على الرغم من الآخر…

Discussion

وصف تقنيات تسمح هنا النظر في ردود الخلايا المناعية للسموم البكتيرية. الخطوة الأكثر أهمية هو التعامل مع والجرعات من السم. يمكن أن يكون النشاط السم متغير للغاية، حتى بين مختلف مأخوذة من إعداد نفسه، بسبب هشاشتها. هذا يتطلب اختبار إما كل قسامة من السم ضد مرجع الخلية أو خط…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.