Визуализация бактериальный токсин индуцированные ответы с помощью флуоресцентной микроскопии Онлайн сотовых

Summary

Методы очистки холестерина обязательного токсина стрептолизин O из рекомбинантных<em> E. палочки</em> И визуализации связывания токсинов жить эукариотических клеток описаны. Локализованные доставки токсин вызывает быстрые и сложные изменения в целевые клетки раскрывая новые аспекты токсина биологии.

Abstract

Бактериальные токсины связываются с холестерином в мембране, образуя поры, которые позволяют утечка клеточного содержимого и притоком материалов из внешней среды. Клетка может либо выйти из этой оскорбление, которое требует активных процессов ремонта мембран, либо умирают в зависимости от количества воздействия токсинов и клетки ^1-го типа. Кроме того, эти токсины вызывают сильную воспалительную реакцию в зараженных хостов через активацию иммунных клеток, включая макрофаги, которые производят множество провоспалительных цитокинов ^2. Многие грамположительных бактерий производить холестерин обязательным токсины, которые, как было показано, способствует их вирулентность в значительной степени через неохарактеризованных механизмов.

Морфологические изменения в плазматической мембране клетки подвергаются воздействию этих токсинов включают их поглощение холестерина в обогащенной поверхности выступов, которые могут быть пролита в межклеточное пространство, что предполагает внутреннюю клеточную защитуМеханизм ^3,4. Этот процесс происходит во всех клетках в отсутствие метаболической активностью и могут быть визуализированы с помощью EM после химической ⁴ фиксации. В иммунных клеток, таких как макрофаги, которые опосредуют воспаление в ответ на воздействие токсинов, индуцированные мембранных везикул предложили, чтобы содержать цитокины IL-1 семья и может быть ответственность как за сброс токсинов и распространения этих провоспалительных цитокинов ^5,6,7. Связь между IL-1β выпуска и определенный тип гибели клеток, называемых pyroptosis была предложена, так как являются каспазы-1 зависимых процессов ^8. Чтобы разобраться в сложностях этого макрофагов ответ, который включает в себя токсины обязательным, упав на мембранных везикул, высвобождение цитокинов и, возможно, гибели клеток, мы разработали методы маркировки и флуоресцентной микроскопии, которые позволяют визуализации реального времени токсина межклеточных взаимодействий, в том числе Измерения дисфункции и смерти (рис. 1). Использоватьиз живых клеток необходимо в связи с ограничениями в других методов. Биохимические подходы не могут решить эффектов, происходящих в отдельных клетках, в то время проточной цитометрии не предлагает высокое разрешение, визуализации в реальном времени отдельных клеток. Методы, описанные здесь, могут быть применены к кинетического анализа ответов индуцированных другие стимулы включают в себя сложные фенотипические изменения в клетках.

Protocol

1. Очистка стрептолизина O (SLO) Инокулировать 20 мл ночной культуры BL21 ЗОЛОТО клеток, содержащих pBADgIII-SLOhis плазмиды 9 в 0,5 бульоне LB L и добавить 500 мкл 50 мг / мл ампициллина. Встряхнуть культуры на 225 оборотов в минуту при 37 ° С до OD 600 = 0,6, как правило, ~ 1,5 часа. Центрифуга 1 мл бак?…

Representative Results

Обычно 10 7 -10 8 ед / мл SLO может быть получена с белком концентрации 4 мг / мл. Количество токсина необходимых для лизиса клеток меняется в зависимости от типа клеток, но, как правило, 125-500 ЕД / мл SLO (рис. 2В). Сотовый типов, таких как макрофаги могут быть более устойчивыми (400…

Discussion

Описанные здесь методы позволяют рассмотрении реакции иммунных клеток к бактериальным токсинам. Самым важным шагом является обработка и дозировки токсина. Токсин деятельности может быть чрезвычайно разнообразен, даже между различными аликвоты того же препарата, из-за его хрупкости. …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.