Visualisering af bakterielt toksin Inducerede Responses Brug af Live Cell Fluorescence Microscopy

Summary

Fremgangsmåder til oprensning af cholesterol binding toksin streptolysin O fra rekombinant<em> E. coli</em> Og visualisering af toxin binding til levende eukaryote celler er beskrevet. Lokal afgivelse af toksin inducerer hurtige og komplekse ændringer i målceller afslører hidtil ukendte aspekter af toksin biologi.

Abstract

Bakterielle toksiner binder til kolesterol i membraner, der danner porer, som tillader lækage af cellulære indhold og tilstrømning af materialer fra det ydre miljø. Cellen kan enten komme sig efter denne fornærmelse, som kræver aktive membran reparationsprocesser, ellers dør afhængigt af mængden af toksin eksponering og celletype ^1. Endvidere inducerer disse toksiner kraftige inflammatoriske reaktioner i inficerede værter ved aktivering af immunceller, herunder makrofager, som producerer en række pro-inflammatoriske cytokiner ^2. Mange Gram-positive bakterier producerer kolesterol bindende toksiner, der har vist sig at bidrage til deres virulens gennem stort set ukarakteriserede mekanismer.

Morfologiske ændringer i plasmamembranen i celler udsat for disse toksiner indbefatter deres binding til cholesterol-berigede overfladefremspring, som kan udskilles til det ekstracellulære rum, hvilket antyder en indre cellulært forsvarmekanisme ^3,4. Denne proces sker på alle celler i fravær af metabolisk aktivitet, og kan visualiseres ved anvendelse EM efter kemisk fiksering ^4. I immunceller, såsom makrofager, som medierer inflammation som reaktion på toksin eksponering, der induceres membranvesikler foreslået at indeholde cytokiner af IL-1-familien og kan være ansvarlige for både kaste toksin og videregiver disse pro-inflammatoriske cytokiner ^5,6,7. En forbindelse mellem IL-1β frigørelse og en særlig type af celledød, er betegnet pyroptosis blevet foreslået, som begge er caspase-1 afhængige processer ^8. At sortere de mange aspekter af dette makrofag reaktion, som omfatter toxinbinding, kaste af membranvesikler, cytokinfrigivelse og potentielt celledød, har vi udviklet mærkningsteknikker og fluorescensmikroskopi metoder, der giver mulighed for real time visualisering af toksin-celle-interaktioner, herunder målinger af dysfunktion og død (figur 1). Brugaf levende celler er nødvendig på grund af begrænsninger i andre teknikker. Biokemiske indfaldsvinkler kan ikke løse effekter forekommer i individuelle celler, mens flowcytometri ikke tilbyder høj opløsning, real-time visualisering af de enkelte celler. Fremgangsmåderne beskrevet her kan anvendes til kinetisk analyse af responser induceret af andre stimuli medfører komplekse fænotypiske forandringer i cellerne.

Protocol

1. Oprensning af streptolysin O (SLO) Inokulere 20 ml overnatskultur af BL21 GOLD celler indeholdende pBADgIII-SLOhis plasmid 9 i 0,5 L LB-bouillon, og der tilsættes 500 pi 50 mg / ml ampicillin. Rystekultur ved 225 rpm ved 37 ° C indtil OD600 = 0,6, sædvanligvis ~ 1,5 timer. Centrifuger 1 ml bakterier (anset T 0) ved 10.000 xg 5 min, opløses pellet i 140 pi 1x SDS prøvepuffer / 1 OD og soniker at forskyde DNA til protein renhed analyse. Inducere bakterier med t…

Representative Results

Typisk 10 7 -10 8 U / ml SLO kan opnås med en proteinkoncentration på 4 mg / ml. Mængden af toksin kræves til cellelysis afhænger af celletypen, men er sædvanligvis fra 125 til 500 U / ml SLO (figur 2B). Celletyper som makrofager kan være mere resistente (4000 U / ml) selvom andre (især T-cellelinier) er mere følsomme. Disse følsomheder svarer til kommercielt tilgængelige SLO. Toksinaktivitet falder omtrent 2 gange med hver fryse-tø, så hemolytiske assays med hvert par…

Discussion

Teknikkerne beskrevet her tillader undersøgelse af responser af immunceller til bakterietoksiner. Det mest kritiske trin er at håndtering og dosering af toksinet. Toksinaktivitet kan være yderst variable, selv mellem forskellige portioner af det samme præparat, på grund af dets skrøbelighed. Dette nødvendiggør enten prøvning af hver enkelt portion af toksin mod en reference cellelinje eller røde blodlegemer eller bruger toksin gradienter. Toxin gradienter, som leveret af mikropipette, tillade det fulde spektru…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.