Visualisering av bakterietoxin Inducerade svar Använda Live Mikroskopi Cell Fluorescens

Summary

Metoder för rening av kolesterol bindande toxinet streptolysin O från rekombinant<em> E. E. coli</em> Och visualisering av toxin bindning till levande eukaryota celler beskrivs. Lokaliserad leverans av toxin inducerar snabba och komplexa förändringar i målceller avslöjar nya aspekter av toxin biologi.

Abstract

Bakteriella toxiner binder till kolesterol i membran, bildar porer som tillåter läckage av cellulära innehåll och inflöde av material från den yttre miljön. Cellen kan antingen återhämta sig från denna förolämpning, som kräver aktiva processer membran reparation, annars dör beroende på mängden av toxin exponering och celltyp ^1. Dessutom är dessa toxiner inducera starka inflammatoriska svar i infekterade värdar genom aktivering av immunceller, inkluderande makrofager, som producerar en rad av proinflammatoriska cytokiner ^2. Många grampositiva bakterier producerar kolesterol bindande toxiner som har visat sig bidra till deras virulens genom i stort sett okarakteriserade mekanismer.

Morfologiska förändringar i plasmamembranet hos celler som exponeras för dessa toxiner inkluderar sin sekvestrering i kolesterolrika yta utsprång, som kan utsöndras i det extracellulära utrymmet, vilket tyder på en inneboende cellulär försvarmekanismen ^3,4. Denna process sker på alla celler i frånvaro av metabolisk aktivitet, och kan visualiseras med användning av EM efter kemisk fixering ^4. I immunceller såsom makrofager som medierar inflammation som svar på toxin exponering induceras membranvesiklar föreslås innehålla cytokiner av IL-1-familjen och kan vara ansvarig både för att kasta toxin och sprida dessa proinflammatoriska cytokiner ^5,6,7. En koppling mellan IL-1β utsläpp och en viss typ av celldöd, har kallas pyroptosis föreslagits, eftersom båda är kaspas-1 beroende processer ^8. Att reda ut komplexiteten i denna makrofag svar, som inkluderar toxin bindande, utsöndring av membranvesiklar, cytokinfrisättning, och potentiellt celldöd, har vi utvecklat märkning tekniker och fluorescens metoder mikroskopi som möjliggör realtid visualisering av toxin-cell-interaktioner, inklusive mätningar av dysfunktion och död (figur 1). Användav levande cell imaging är nödvändigt på grund av begränsningar i andra tekniker. Biokemiska metoder kan inte lösa effekter som uppträder i enskilda celler, medan flödescytometri inte erbjuda hög upplösning, realtid visualisering av individuella celler. De metoder som beskrivs här kan tillämpas på kinetisk analys av svar som induceras av andra stimuli involverar komplexa fenotypiska förändringar i celler.

Protocol

1. Rening av streptolysin O (SLO) Inokulera 20 ml nattgammal kultur av BL21 GOLD celler innehållande pBADgIII-SLOhis plasmiden 9 i 0,5 L LB-buljong och tillsätt 500 pl 50 mg / ml ampicillin. Skaka kultur vid 225 rpm vid 37 ° C tills OD 600 = 0,6, vanligtvis ~ 1,5 timmar. Centrifugera 1 ml bakterier (anses T 0) vid 10.000 xg 5 minuter, lös pelleten i 140 ul 1x SDS provbuffert / 1 OD och sonikera att klippa DNA för protein renhet analys. Inducera bakterier med til…

Representative Results

Typiskt 10 7 -10 8 U / ml SLO kan erhållas med en proteinkoncentration av 4 mg / ml. Den mängd av toxin som krävs för cellys varierar beroende celltyp, men är vanligen 125-500 U / ml SLO (Figur 2B). Celltyper som makrofager kan vara mer motståndskraftiga (4000 U / ml) men andra (speciellt T-cellinjer) är mer känsliga. Dessa känsligheter motsvarar kommersiellt tillgänglig SLO. Toxin aktivitet minskar ungefär 2-faldigt med varje frys-tö, så hemolytiska analyser med varje…

Discussion

De tekniker som beskrivs här tillåta undersökning av svaren från immunceller till bakteriella toxiner. Det mest kritiska steget är hantering och dosering av toxinet. Toxinaktivitet kan vara extremt varierande, även mellan olika alikvoter av samma beredning, på grund av dess bräcklighet. Detta kräver antingen testa varje alikvot av toxin mot en referens cellinje eller RBC eller använda toxin gradienter. Toxin gradienter, som levereras av mikropipett, låt hela spektrumet av toxin-inducerade aktiviteter som skal…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Ni-NTA agarose	Qiagen	30210
polymixin-agarose	Sigma	P1411-5ML
Zeba Desalt Spin col	Fisher	PI-89891
sheep RBCs	Fisher	50-415-688
pBADgIII-SLO	N/A	N/A	see ref9
Cy5 monoreactive dye	GE Healthcare	PA25001
Fura2-AM	Life Technologies	F1221
Calcein AM/ Ethidium homodimer	Life Technologies	L3224
Anti-CD11c-APC	BD Biosciences	550261
collagen-coated glass-bottom dish	Mattek	P35GCol-1.5-10-C
femto-tip II	Fisher	E5242957000
Microloader	Fisher	E5242956003
dextran Alexa 555	Life Technologies	D34679
Injectman NI 2	Eppendorf	920000029
FemtoJet	Eppendorf	5247 000.013
			Table 1. List and source of specific reagents and equipment needed. Specific equipment and reagents used in this protocol, along with company and catalogue number are listed.
			Buffer Composition Step Used Lyse/Wash 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole, pH 8.0 1.4 Tris/salt 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 1.7 Elution buffer 50 mM Tris, pH 8.0 300 mM NaCl 250 mM imidazole 1.8 RBC Assay buffer 0.3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7.4 2.1 buffer R/B RPMI cell culture medium 2 mM CaCl2 0.5% BSA 3.1
			Table 2. List of buffers used in this protocol. The buffers used, their composition and the first step at which they are used in the protocol are listed.