Användning av primära humana fibroblaster för övervakning Mitokondriella fenotyper inom området för Parkinsons sjukdom

Summary

Fibroblaster från patienter som bär mutationer i Parkinsons sjukdom som orsakar gener utgör en lättillgänglig<em> Ex vivo</em> Modell för att studera sjukdomar associerade fenotyper. Levande cell imaging ger möjlighet att studera morfologiska och funktionella parametrar i levande celler. Här beskriver vi framställningen av mänskliga fibroblaster och efterföljande övervakning av mitokondriella fenotyper.

Abstract

Parkinsons sjukdom (PS) är den näst vanligaste rörelsestörning och drabbar 1% av befolkningen äldre än 60 ^1. Eftersom åldrande är den viktigaste riskfaktorn, kommer fall av PD öka under de närmaste årtiondena ^2. Bredvid patologisk proteinveckning och försämrade protein vägar nedbrytning har förändringar av mitokondriernas funktion och morfologi pekades ut som ytterligare kännetecken för neurodegeneration i PD ^3-11.

Efter år av forskning i murina och humana cancerceller som in vitro-modeller för att dissekera molekylära vägar för parkinsonism, har användningen av humana fibroblaster från patienter och lämpliga kontroller som ex vivo-modeller blivit ett värdefullt instrument för forskning om potentiella förbehåll beaktas. Annat än odödliggjorda ganska artificiella cellmodeller, primära fibroblaster från patienter som bär sjukdom-associerade mutationer speglar uppenbarligen viktiga patologiska drag of den mänskliga sjukdomen.

Här har vi avgränsa förfarandet för att ta hudbiopsier, odling humana fibroblaster och använda detaljerade protokoll för viktiga mikroskopiska tekniker för att definiera mitokondriella fenotyper. Dessa användes för att undersöka olika funktioner i samband med PD som är relevanta för mitokondriell funktion och dynamik. Ex vivo kan mitokondrier analyseras i termer av deras funktion, morfologi, samlokalisering med lysosomer (de organeller förnedrande dysfunktionella mitokondrier) och nedbrytning via lysosomala vägen . Dessa fenotyper är högst relevanta för identifieringen av tidiga tecken på PD och kan föregå kliniska motoriska symtom i mänskliga sjukdomar genbärare. Därför kan de analyser som presenteras här kan användas som värdefulla verktyg för att identifiera patologiska funktioner i neurodegeneration och hjälper till att definiera nya terapeutiska strategier PD.

Protocol

1. Hudbiopsi och Odling av humana fibroblaster Huden biopsi måste tas av en erfaren läkare. Förfarandet sker under sterila förhållanden och kräver lokalbedövning. Typiska platser som används för biopsi är insidan av överarmen, axel eller nedre delen av ryggen. Du kan ta 4x4mm eller 6x6mm diameter prov genom stansbiopsi att få tillräckligt med vävnad för odling mänskliga fibroblaster. Skär hudbiopsi i lika små bitar under sterila betingelser för att separera dem i 2-4 T25…

Discussion

Patientens hud fibroblaster som ex vivo-modeller utgör ett viktigt verktyg för att karakterisera sjukdomsassocierade genetiska defekter. Dessutom, hud-härledda fibroblaster är lättillgängliga och kan utökas vid odling. Därför, primära celler erhållna från patienter som bär PD-associerade genetiska mutationer är att föredra jämfört med användningen av tumörcellinjer eftersom de innehåller inte bara den endogena sjukdomsorsakande genen, men hela den genetiska bakgrunden av den drabbade individ…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue no.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.