L'utilisation de fibroblastes humains primaires pour la surveillance des phénotypes mitochondriales dans le domaine de la maladie de Parkinson
Summary
Les fibroblastes de patients porteurs de mutations dans la maladie de Parkinson pathogènes gènes représentent une forme accessible facilement<em> Ex vivo</em> Modèle pour étudier les maladies associées à des phénotypes. Imagerie des cellules vivantes donne l'occasion d'étudier les paramètres morphologiques et fonctionnelles dans les cellules vivantes. Ici, nous décrivons la préparation de fibroblastes humains et la surveillance ultérieure des phénotypes mitochondriales.
Abstract
La maladie de Parkinson (MP) est le trouble du mouvement le plus fréquent et touche 1% de la population âgée de plus de 60 1. Parce que le vieillissement est le facteur de risque le plus important, les cas de PD augmentera au cours des prochaines décennies 2. A côté de repliement des protéines pathologiques et dépréciés voies de dégradation des protéines, des altérations de la fonction mitochondriale et la morphologie ont été signalées comme caractéristique supplémentaire de la neurodégénérescence dans la MP 3-11.
Après des années de recherche dans les cellules cancéreuses murines et humaines comme dans les modèles in vitro pour disséquer les voies moléculaires de Parkinson, l'utilisation de fibroblastes humains provenant de patients et les contrôles appropriés que les modèles ex vivo est devenu un outil de recherche précieux, si mises en garde potentiels sont pris en compte. Autre que immortalisées, des modèles cellulaires plutôt artificielles, des fibroblastes primaires de patients porteurs de mutations associées à la maladie reflètent apparemment importantes caractéristiques pathologiques of la maladie humaine.
Ici, nous délimiter la procédure de prise de biopsies de la peau, les fibroblastes humains en culture et l'utilisation de protocoles détaillés pour des techniques de microscopie essentielles pour définir des phénotypes mitochondriales. Ceux-ci ont été utilisés pour étudier les différentes caractéristiques associés à la MP qui sont pertinents pour la fonction mitochondriale et dynamique. Ex vivo, les mitochondries peuvent être analysés en termes de leur fonction, la morphologie, la colocalisation avec les lysosomes (les organites dégradants dysfonction mitochondriale) et la dégradation via la voie lysosomale . Ces phénotypes sont très pertinents pour l'identification des signes précoces de maladie de Parkinson et peuvent précéder les symptômes moteurs cliniques dans la maladie de l'homme et les gènes transporteurs. Par conséquent, les analyses présentées ici peuvent être utilisés comme des outils précieux pour identifier les caractéristiques pathologiques de la neurodégénérescence et de contribuer à définir de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la maladie de Parkinson.
Protocol
Discussion
Fibroblastes de peau de patients comme des modèles ex vivo représentent un outil important pour caractériser les maladies associées à des anomalies génétiques. En outre, la peau dérivés de fibroblastes sont facilement accessibles et peuvent être développées en culture. Par conséquent, les cellules primaires obtenues à partir de patients porteurs de mutations associées à PD génétiques sont préférables à l'utilisation de lignées cellulaires tumorales, car ils contiennent non seulement en…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Fritz Thyssen (10.11.2.153 à RK), le Conseil de recherches en allemand (DFG, KR2119/3-2 et KR2119/8-1 à RK), le ministère fédéral de l'Éducation et de la Recherche (BMBF , NGFNplus; 01GS08134 à RK) et par une bourse doctorale de la Fondation de bienfaisance Hertie [au LFB]. Nous remercions Carolin Obermaier et Julia Westermeier pour leur soutien pendant le tournage du clip.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue no. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Invitrogen | 52400-025 |
| RPMI 1640 medium, no Phenol Red | Invitrogen | 11835-063 |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Invitrogen | 14190-094 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | PeproTech | 100-18B |
| AccuMax (detachment solution) | PAA | L11-008 |
| Lab-TekTMII chambered coverglasses | Nalge Nunc International | 115382 |
| Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE) | Invitrogen | T-669 |
| Mitotracker Green FM | Invitrogen | M-7514 |
| Mitotracker CM-H2XRos | Invitrogen | M-7513 |
| Lyostracker Red DND-99 | Invitrogen | L-7528 |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H-3570 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
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