Bruk av primære humane fibroblaster for overvåking Mitokondrielle Fenotyper i feltet av Parkinsons sykdom

Summary

Fibroblaster fra pasienter bærer mutasjoner i Parkinsons sykdom-forårsaker gener representerer en lett tilgjengelig<em> Ex vivo</em> Modell for å studere sykdomsassosierte fenotyper. Levende celle bildebehandling gir mulighet til å studere morfologiske og funksjonelle parametre i levende celler. Her beskriver vi utarbeidelse av humane fibroblaster og påfølgende oppfølging av mitokondrie fenotyper.

Abstract

Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste bevegelse lidelse og rammer 1% av personer over 60 år ^en. Fordi aldring er den viktigste risikofaktor, vil tilfeller av PD øke i løpet av de neste tiårene ^2. Ved siden av patologisk protein folding og nedsatt protein degradering pathways, ble endringer i mitokondrienes funksjon og morfologi påpekt som ytterligere kjennetegn på neurodegeneration i PD ^3-11.

Etter års forskning i murine og humane kreftceller som in vitro modeller for å dissekere molekylære mekanismene i parkinsonisme, har bruken av menneskelige fibroblaster fra pasienter og hensiktsmessige kontroller som ex vivo-modeller blitt et verdifullt verktøy for forskning, hvis potensielle begrensningene er vurdert. Annet enn udødeliggjort, heller kunstige celle-modeller, primære fibroblaster fra pasienter bærer sykdom mutasjoner tilsynelatende reflekterer viktige patologiske funksjoner of sykdom hos mennesker.

Her har vi avgrense prosedyren for å ta hud biopsier, dyrking humane fibroblaster og ved hjelp av detaljerte protokoller for viktige mikroskopiske teknikker for å definere mitokondrie fenotyper. Disse ble brukt til å undersøke ulike funksjoner knyttet til PD som er relevante for mitokondrie funksjon og dynamikk. Ex vivo, kan mitokondrier bli analysert i forhold til sin funksjon, morfologi, colocalization med lysosomer (organelles nedverdigende dysfunksjonelle mitokondrier) og nedbrytning via lysosomal vei . Disse fenotyper er svært relevant for identifisering av tidlige tegn på PD og kan gå forut kliniske motoriske symptomer i menneskelig sykdom-genet. Derfor kan analysene som presenteres her brukes som verdifulle verktøy for å identifisere patologiske trekk ved neurodegeneration og bidra til å definere nye terapeutiske strategier i PD.

Protocol

1. Hudbiopsi og Dyrking av humane fibroblaster Den hudbiopsi må tas av en erfaren lege. Prosedyren foregår under sterile betingelser og krever lokal anestesi. Typiske områder som brukes for biopsi er den indre side av den øvre arm, skulder eller korsryggen. Du kan ta 4x4mm eller 6x6mm diameter prøven ved punch biopsi for å få nok vev for dyrking humane fibroblaster. Skjær hudbiopsi i like små biter under sterile forhold for å skille dem i 2-4 T25 flasker. Hver kolbe bør innehold…

Discussion

Pasient hudfibroblaster som ex vivo-modeller representerer et viktig verktøy for å karakterisere sykdomsassosierte genetiske defekter. I tillegg, hud-avledede fibroblaster er lett tilgjengelige og kan utvides ved dyrkning. Derfor, primære celler oppnådd fra pasienter som frakter PD-assosierte genetiske mutasjoner er å foretrekke fremfor bruk av tumorcellelinjer som de inneholder ikke bare den endogene sykdomsfremkallende genet, men hele genetiske bakgrunnen for berørte enkelte. Videre har de vist seg å f…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue no.
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium	Invitrogen	52400-025
RPMI 1640 medium, no Phenol Red	Invitrogen	11835-063
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS)	Invitrogen	14190-094
Fibroblast growth factor 2 (FGF2)	PeproTech	100-18B
AccuMax (detachment solution)	PAA	L11-008
Lab-TekTMII chambered coverglasses	Nalge Nunc International	115382
Tetramethylrodamine ethyl ester (TMRE)	Invitrogen	T-669
Mitotracker Green FM	Invitrogen	M-7514
Mitotracker CM-H2XRos	Invitrogen	M-7513
Lyostracker Red DND-99	Invitrogen	L-7528
Hoechst 33342	Invitrogen	H-3570

Table 1. Specific reagents and equipment.