Utvinning av Tissue Antigener for Funksjonell Assays
Summary
En enkel protokoll for fremstilling ekstrakter av menneskelig vev som skal brukes som en kilde for antigener i funksjonelle T-celle-analyser er beskrevet. Denne metoden tillater T-celle responser på vev-avledede antigener skal måles<em> In vitro</em>.
Abstract
Mange av antigenet målene for adaptiv immunrespons, anerkjent av B-og T-celler, er ikke blitt definert 1. Dette gjelder særlig i autoimmune sykdommer og kreft to. Vårt mål er å undersøke antigener anerkjent av humane T-celler i autoimmune sykdom type 1 diabetes 1,3,4,5. Å analysere humane T-celle responser mot vev der antigener gjenkjent av T-celler er ikke identifisert vi utviklet en metode for å utvinne protein antigener fra humant vev i et format som er kompatibelt med funksjonelle analyser 6. Tidligere, T-celle responser på urenset vev ekstrakter kunne ikke måles fordi hentingsmetodene gi et lysat som inneholdt vaskemidler toksiske for humane perifere mononukleære blodceller. Her beskriver vi en protokoll for å trekke proteiner fra menneskelig vev i et format som ikke er giftig for humane T-celler. Vevet homogeniseres i en blanding av butan-1-ol, acetonitril og watER (BAW). Proteinkonsentrasjonen i vevekstrakt måles og en kjent masse av protein er alikvoteres inn rør. Etter ekstraksjon, blir de organiske løsningsmidler fjernet ved lyofilisering. Lyofiliserte vev ekstrakter kan lagres inntil nødvendig. For bruk i analyser av immunfunksjonen, en suspensjon av immunceller, i hensiktsmessige dyrkningsmedier, kan legges direkte på den lyofiliserte ekstrakt. Cytokin produksjon og proliferasjon av PBMC, som svar på ekstrakter fremstilt ved hjelp av denne metoden, ble lett målt. Derfor tillater vår metode den raske fremstilling av humane vev lysater som kan brukes som en kilde for antigener i analysen av T-celle responser. Vi foreslår at denne metoden vil lette analysen av adaptive immunresponser mot vev i transplantasjon, kreft og autoimmunitet.
Protocol
Discussion
Denne protokollen ble utviklet fordi vi ønsket å generere et utdrag fra menneskelig vev som var fri for giftige kjemikalier som vaskemidler. Spesifikt vi har brukt det å forberede ekstrakter av menneskelig vev som kan brukes i analyser av humant immun funksjon in vitro. Ekstrakter fremstilt ved hjelp av denne protokollen kan likeledes rekonstitueres i enhver buffer og brukes for mange biokjemiske analyser, som Western blotting eller væskekromatografi. Dette gjør denne teknikken som gjelder for mange nedstr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er støttet med tilskudd fra Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) og Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) og Operational Infrastruktur Scheme av den viktorianske regjeringen. Vi takker medlemmene av Tom Mandel Islet Transplantasjon Program Islet Isolation Team for å gi de menneskelige vev. Menneskelig vev ble samlet inn og brukt med lokal etisk godkjenning (St. Vincent Hospital HREC-A 011/04 og St. Vincent er Helse HREC-A 135/08).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 5 ml 12 x 75 mm sterile polystyrene tubes | BD Falcon | 352054 | |
| Caps for tubes polystyrene tubes (above) | BD Falcon | 352032 | |
| 50ml sterile tubes | Becton Dickinson | 352070 | |
| Acetonitrile | Mallinckradt Chemicals | 2856-10 | |
| Butan-1-ol | Sigma Aldrich | 537993-IL | |
| Homogenizer: PRO200 | Bio-strategy | 01-01200 | 10 x 115 mm saw-tooth generator |
| Lyophilizer | Virtis, Benchtop 4K | ||
| Sterile Needle 18-20 gauge | Becton Dickinson | REF 302032 | |
| CMRL-1066 Medium | Sigma | C0422 | |
| PBS | Sigma | D8537 |
Table 1. Specific reagents and equipment.
References
- Mannering, S. I. Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).
- Beckhove, P. Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation. J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).
- Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes. Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).
- Mannering, S. I. The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes. Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).
- Mannering, S. I. The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified. J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).
- Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays. Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).
- Mannering, S. I. A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells. J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).
- Mannering, S. I. CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).
- Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide. Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).
- Peakman, M. Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes. Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).
- Honey, K., Rudensky, A. Y. Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation. Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).
