Biofabrication साथ इंटरफेस जैव इलेक्ट्रॉनिक खाई
Summary
यह लेख एक biofabrication दृष्टिकोण का वर्णन: पक्षपाती biocompatible है फिल्मों है जो कोशिकाओं या प्रोटीन के साथ है functionalized किया जा सकता है बनाने के इलेक्ट्रोड की उपस्थिति में उत्तेजनाओं उत्तरदायी polysaccharides के बयान. हम के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रयोगशाला-on-a-चिप अनुप्रयोगों के लिए इंटरैक्टिव biofunctionalized सतहों बनाने के लिए फिल्मों को उनके मूल का उपयोग करता है की पीढ़ी के लिए एक पीठ टॉप रणनीति प्रदर्शित करता है.
Abstract
Advancements in lab-on-a-chip technology promise to revolutionize both research and medicine through lower costs, better sensitivity, portability, and higher throughput. The incorporation of biological components onto biological microelectromechanical systems (bioMEMS) has shown great potential for achieving these goals. Microfabricated electronic chips allow for micrometer-scale features as well as an electrical connection for sensing and actuation. Functional biological components give the system the capacity for specific detection of analytes, enzymatic functions, and whole-cell capabilities. Standard microfabrication processes and bio-analytical techniques have been successfully utilized for decades in the computer and biological industries, respectively. Their combination and interfacing in a lab-on-a-chip environment, however, brings forth new challenges. There is a call for techniques that can build an interface between the electrode and biological component that is mild and is easy to fabricate and pattern.
Biofabrication, described here, is one such approach that has shown great promise for its easy-to-assemble incorporation of biological components with versatility in the on-chip functions that are enabled. Biofabrication uses biological materials and biological mechanisms (self-assembly, enzymatic assembly) for bottom-up hierarchical assembly. While our labs have demonstrated these concepts in many formats 1,2,3, here we demonstrate the assembly process based on electrodeposition followed by multiple applications of signal-based interactions. The assembly process consists of the electrodeposition of biocompatible stimuli-responsive polymer films on electrodes and their subsequent functionalization with biological components such as DNA, enzymes, or live cells 4,5. Electrodeposition takes advantage of the pH gradient created at the surface of a biased electrode from the electrolysis of water 6,7,. Chitosan and alginate are stimuli-responsive biological polymers that can be triggered to self-assemble into hydrogel films in response to imposed electrical signals 8. The thickness of these hydrogels is determined by the extent to which the pH gradient extends from the electrode. This can be modified using varying current densities and deposition times 6,7. This protocol will describe how chitosan films are deposited and functionalized by covalently attaching biological components to the abundant primary amine groups present on the film through either enzymatic or electrochemical methods 9,10. Alginate films and their entrapment of live cells will also be addressed 11. Finally, the utility of biofabrication is demonstrated through examples of signal-based interaction, including chemical-to-electrical, cell-to-cell, and also enzyme-to-cell signal transmission.
Both the electrodeposition and functionalization can be performed under near-physiological conditions without the need for reagents and thus spare labile biological components from harsh conditions. Additionally, both chitosan and alginate have long been used for biologically-relevant purposes 12,13. Overall, biofabrication, a rapid technique that can be simply performed on a benchtop, can be used for creating micron scale patterns of functional biological components on electrodes and can be used for a variety of lab-on-a-chip applications.
Protocol
Discussion
हमारे प्रक्रियाओं electrodeposition और biopolymer फिल्मों के functionalization, एक हम biofabrication अवधि प्रक्रिया प्रदर्शित करता है. कोशिकाओं और biomolecules साथ functionalization के माध्यम से हम जैविक सतहों एक दूसरे को और इलेक्ट्रोड पते पर वे इकट्ठा कर रहे हैं के साथ बातचीत करने में सक्षम बनाते हैं. पहला कदम, electrodeposition, ट्रिगर, biopolymers है, और हमारे अध्ययन में alginate chitosan के विधानसभा स्वयं के माध्यम से एक बिजली के संकेत के जवाब में जगह लेता है. जैसा कि पहले कहा पीएच ढाल उत्पन्न होता है जो वर्तमान घनत्व और बयान समय से नियंत्रित किया जा सकता है, फिल्म आयाम और 6,17 गुणों के अतिरिक्त नियंत्रण प्रदान. हमने पाया है कि वर्तमान घनत्व और बयान समय संयोजनों की एक किस्म तालिका 1 में दर्शाए गए इलेक्ट्रोड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. जबकि अन्य इलेक्ट्रोड का उपयोग संभव है, प्रक्रिया के समायोजन आवश्यक हो जाएगा. फिल्म के गठन अन्य electrodeposi की प्रक्रिया तकनीक के साथ तुलना मेंइस tion सरल, तीव्र और reagentless है. महंगे उपकरण और श्रमसाध्य तैयारी की एक व्यापक प्रदर्शनों की सूची के लिए कोई ज़रूरत नहीं है. महत्वपूर्ण बात, इस प्रक्रिया को मामूली प्रयोगात्मक विचलन का सामना और आसानी से शुरू कर सकते हैं यदि कोई समस्या उत्पन्न होती है सकते हैं.
Chitosan एक उच्च cathodic पीएच महत्वपूर्ण कार्य यह करने के लिए प्राथमिक amines के एक उच्च सामग्री के द्वारा प्रदत्त गुण के कारण ढाल करने के लिए जवाब देने में सक्षम है. उच्च pH (6.3 ~ की pKa से अधिक) पर amines deprotonated और chitosan के अघुलनशील हो जाता है, फिल्म निर्माण के लिए अनुमति देता है. बयान के बाद, फिल्म इलेक्ट्रोड के लिए संलग्न रहेगा. हालांकि, क्षमता उन्हें delaminate अगर वांछित मौजूद है. फिल्मों समाधान के पीएच pKa नीचे छोड़ नहीं करता है के रूप में लंबे समय के रूप में स्थिर रहेगा. अम्लीय समाधान के amines protonate बाद electrostatic repulsions जेल प्रफुल्लित जब तक यह 18 घुल. यही है, प्रक्रिया विधानसभा / disassembly के मांग और allo पर पलटवाँ हैजमा फिल्मों और इलेक्ट्रोड का पुन: उपयोग के हटाने के लिए गया था. आसानी से, पीएच सीमा जिस पर प – जेल संक्रमण जगह लेता है कि जो में सबसे जैविक घटकों बेहतर कार्य के लिए करीब है. यह 6 विधानसभा दौरान कार्यक्षमता की अवधारण के लिए प्रक्रिया आदर्श बनाता है.
Alginate फिल्म गठन पानी की anodic इलेक्ट्रोलीज़ के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैल्शियम कार्बोनेट 7 की उपस्थिति से मदद की है. anode पर स्थानीयकृत कम पीएच कैल्शियम रिहाई कैल्शियम फैटायनों के लिए अग्रणी कार्बोनेट solubilizes. इन आयनों alginate द्वारा chelated कर रहे हैं, इलेक्ट्रोड सतह पर एक crosslinked नेटवर्क बनाने. Alginate फिल्मों साइट्रेट या EDTA के रूप में अन्य chelating यौगिकों, जो फिल्मों को भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अंतर्निहित इलेक्ट्रोड का पुनः प्रयोग के लिए अनुमति देने से कैल्शियम आयनों के लिए प्रतिस्पर्धा द्वारा विशेष रूप से पलटवाँ हैं. इस प्रकार, alginate फिल्मों के अपेक्षाकृत कमजोर है जब शारीरिक शर्तों के अधीन हैं क्योंकि कैल्शियम आयनों आसानी से कर रहे हैंजेल मैट्रिक्स से cavenged, इसकी संरचना कमजोर है और फिल्म को बढ़ावा देने के delamination या redissolution. इस सीमा पर काबू पाने के लिए, हम इस फिल्म के लिए एक एम 1 2 CaCl में ऊष्मायन चरण के लिए जेल को मजबूत बनाने शामिल है. इसके अतिरिक्त, हम अनुशंसा करते हैं कि फिल्म के ऊष्मायन समाधान (सेल मीडिया, आदि) 2 CaCl साथ 500 मिमी माइक्रोन-3 की एकाग्रता में पूरक होना.
दूसरा प्रमुख प्रक्रिया फिल्म प्रासंगिक जैविक घटकों के साथ जमा की functionalization है. यह दो तरीके हैं, पहली बार जा रहा विद्युत विकार, एक रणनीति है कि तेजी से, असाधारण स्थानिक 10 नियंत्रण के साथ प्रोटीन की reagentless विधानसभा के लिए अनुमति देता है में प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, इस तरह से functionalization, सीएल के प्रसार द्वारा सीमित है – फिल्म के माध्यम से इलेक्ट्रोड आयनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से HOCl का प्रसार, उत्पन्न प्रतिक्रियाशील मध्यवर्ती, समाधान में वापस बाहर. electrochemically सक्रिय अणुओं की क्षमता पारित करने के लिएफिल्म के माध्यम से आसान को पढ़ने के लिए बिजली 15 संकेतों में रासायनिक और जैविक संकेतों के पारगमन के लिए अनुमति देता है. हम chitosan के लिए एंजाइम functionalization के लिए एक दूसरे की रणनीति के रूप में tyrosinase की मध्यस्थता युग्मन दिखाया है, covalently ऐ – 2 Synthase संलग्न द्वारा प्रदर्शन. एक विशिष्ट अभिकर्मक, tyrosinase, जो एक tyrosine 9 टैग युक्त प्रोटीन पर discriminately में कार्य करता है पर निर्भर – इस रणनीति functionalization प्रक्रिया नियंत्रित और चयनात्मक होना करने की अनुमति देता है.
हम उपयोगिता और एक चिप पर प्राकृतिक रास्ते नकल biocompatibility बहु – पता प्रणालियों के दिखाते हैं. पहले हम अलग पते पर दो सेल आबादी (यानी "प्रेषकों" और "रिसीवर") का आयोजन किया, और पता चला है कि वे आसन्न इलेक्ट्रोड भर में बातचीत करने के लिए ऐ-2 देने और एक प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया उत्पन्न. इस अवधारणा को भी चेंग एट अल द्वारा प्रदर्शन किया गया. एक microfluidic चिप में 14. हम भी बातचीत मजाक उड़ाया, लेकिन बजाय प्रयोग किया जाताऐ-2 synthesize करने के वितरण के लिए एंजाइम. इस तरह, एक सिंथेटिक intracellular मार्ग है, ऐ – 2 संश्लेषण biofabrication के माध्यम से दोहराया गया था और बहुत कार्य के रूप में यह समाधान में होगा.
दोनों ही मामलों में, एकाधिक पतों की विधानसभा क्योंकि प्रत्येक समाधान के बयान पूरे इलेक्ट्रोड सरणी के लिए शुरू किया जाना चाहिए, भले ही electrodeposition केवल एक पते पर करना है पते के बीच गैर विशिष्ट बंधन से बचने की चुनौती प्रस्तुत करता है. कोमल अभी तक पूरी तरह से धोने गैर पक्षपाती इलेक्ट्रोड से अवशिष्ट समाधान के बहुमत को दूर कर सकते हैं, microfluidic चैनलों में आगे प्रवाह का उपयोग गैर विशिष्टता कम से कम हो सकता है. Chitosan के और alginate पते के आसन्न biofabrication के लिए विशेष रूप से, हम chitosan फिल्म पहले जमा, biofunctionalization कदम के साथ इस का पालन करने की सलाह देते हैं, और इस के बाद, electrodepositing alginate. हालांकि हम तो यहाँ नहीं किया है, हमने पाया है कि निष्क्रिय प्रोटीन (जैसे मिल के रूप में के साथ chitosan के फिल्म अवरुद्धकश्मीर, बीएसए, आदि) बहुत में chitosan aminated सतह अवांछित अणुओं के गैर विशिष्ट बंधन घटता है.
हम नमूनों इलेक्ट्रोड, अक्सर BioMEMS उपकरणों में पाया कोशिकाओं और biomolecules के एक जटिल व्यवस्था के लिए "खाका" के रूप में स्थापित करने में उपयोगिता पाया है. का उपयोग करता है electrodeposited BioMEMS उपकरणों में chitosan उदाहरण अच्छी तरह से परे जा सकते हैं 19 यहाँ उल्लेख किया है. Microchannels में और गैर planar 20,15 सतहों पर जैसे – chitosan विभिन्न microscale geometries पर जमा किया जा सकता है. फिल्मों को भी अन्य पॉलिमर और एक किस्म के प्रोटीन, डीएनए, नैनोकणों, और उपन्यास 21,22,23 गुण के लिए redox सक्रिय अणुओं के साथ संशोधित किया जा सकता है. BioMEMS उपकरणों में chitosan फिल्मों दवा वितरण, redox और छोटे अणु का पता लगाने, biocatalysis, और सेल 20,23,24,25 अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है. इसी तरह, alginate व्यापक रूप से एक मैट्रिक्स सेल फंसाने के रूप में प्रयोग किया जाता है और है के पलटवाँ की fluidic रोकथाम के लिए पता लगाया गयासेल आबादी और फिल्म में 26,27,28 immunoanalysis. ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए समग्र फिल्मों alginate electrodeposition का उपयोग किया गया 29 आर्थोपेडिक प्रत्यारोपण के लिए hydroxyapatite साथ जैसे घटकों के साथ, गढ़े.
हमारे प्रदर्शनों की biofabrication में हम समान रूप से लागू हो जैविक घटकों के बीच और जैव इलेक्ट्रॉनिक इंटरफ़ेस भर दोनों बातचीत से पता चला है, इस पर चिप संकेत संचरण में परिष्कृत प्रदर्शन के लिए बातचीत की सभी किस्मों को एकीकृत करने की संभावना तक पहुँचने में लाता है. तदनुसार, biofabrication के कम के रूप में "न्यूनतम सुविधा आकार के साथ उपकरणों के निर्माण की सुविधा हो सकती है एक सीधे पर कि microfabrication में तेजी से विकास, के रूप में अक्सर उपभोक्ता इलेक्ट्रॉनिक्स द्वारा प्रेरित करने के लिए – का पालन करें. यही है, अगले अगली पीढ़ी के उपकरणों वास्तव में अस्थायी जैविक घटक है कि प्रकृति के उत्तम और विधानसभा में भी छोटे लंबाई sca के मान्यता क्षमताओं की पेशकश शामिल हो सकता हैमानव निर्मित सिस्टम से लेस. हम विश्लेषणात्मक उपकरण, पर्यावरण सेंसर, और भी biocompatible है implantable उपकरणों में निकट भविष्य अनुप्रयोगों कल्पना.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम DTRA से इस पांडुलिपि की सहायता के लिए और ONR,, DTRA, और NSF से अंतर्निहित अनुसंधान का आंशिक समर्थन के लिए धन स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name of the component | Company | Catalogue number |
| Power Supply | Keithley | SourceMeter 2400 |
| Three electrode potentiostat | CH Instruments | Potentiostat/Galvanostat 600D |
| RE-5B Ag/AgCl Reference Electrode with Flexible Connector | BASi | MF-2052 |
| Gold coated silicon wafer, 500um Si, 12nM Cr, 120nM Au, SiO2 for insulation | custom fabricated | |
| Indium Tin oxide coated glass slide, rectangular, 8-12 ohm resist | Sigma-Aldrich | 578274 |
| Platinum sheet/foil (0.002 in) | Surepure Chemetals | 1897 |
| Slim Line 2″ Alligator Clips | RadioShack | 270-346 |
| Multi-Stacking Banana Plug Patch Cord | TSElectronic | B-36-02 B-24-02 |
| SYLGARD 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | NC9020938 From Fischer |
| Fluorescecence stereomicroscope | Olympus | MVX10 MacroView |
| cellSens Standard | Olympus | version 1.3 |
Table 1. Electrodeposition and fluorescence visualization equipment.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Chitosan, medium molecular weight | Sigma-Aldrich | 448877 |
| Hydrochloric Acid, ARISTAR. ACS, NF, FCC Grade | VWR | BDH3030 |
| Sodium Hydroxide, Solution. 10.00N | VWR | VW3247 |
| Alginic acid, sodium salt | Sigma-Aldrich | 180947 |
| Multifex-MM Precipitated Calcium Carbonate, 70nm particles |
Speciality Minerals Inc. |
100-3630-3 |
Table 2. Chitosan and alginate solution reagents.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Calcium chloride, dihydrate | J.T. Baker | 0504 |
| Sodium Chloride, Certified ACS crystalline |
Fischer Scientific |
S271 |
| Potassium Phosphate Monobasic, anhydrous | Sigma-Aldrich | P9791 |
| Potassium Phosphate Dibasic, anhydrous | Sigma- Aldrich | P3786 |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma- Aldrich |
P4417 |
Table 3. Other solution components and buffer reagents.
| Name of the reagent | Company/Source | Catalogue number |
| Glucose oxidase from aspergillus niger | Sigma-Aldrich | G2133 |
| Tyrosinase from mushroom | Sigma-Aldrich | T3824 |
| LB broth, Miller (granulated) | Fischer Scientific | BP9723-2 |
| “AI2-Synthase” (HGLPT) | Lab stock 16 | |
| W3110 wildtype cells | Lab stock 30 | |
| MDAI2 + pCT6-lsrR–ampr + pET-dsRed–kanr cells | Lab stock 30 | |
| FluoroSpheres: 1μm diameter, Ex/Em: 505/515 | Invitrogen | F8765 |
| 5-(and-6)-carboxyrhodamine 6G succinimidyl ester, Ex/Em: 525/560 | Invitrogen | C-6157 |
| DyLight antibody labeling kit, 405 | Thermo Scientific | PI-53020 |
Table 4. Enzymes, cells, and other functionalization reagents.
References
- Luo, X. In situ generation of pH gradients in microfluidic devices for biofabrication of freestanding, semi-permeable chitosan membranes. Lab Chip. 10, 59-65 (2010).
- Javvaji, V., Baradwaj, A. G., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Light-Activated Ionic Gelation of Common Biopolymers. Langmuir. 27, 12591-12596 (2011).
- Dowling, M. B., Javvaji, V., Payne, G. F., Raghavan, S. R. Vesicle capture on patterned surfaces coated with amphiphilic biopolymers. Soft Matter. 7, 1219-1226 (2011).
- Liu, Y. Biofabrication to build the biology-device interface. Biofabrication. 2, 022002-022002 (2010).
- Yang, X., Shi, X. -. W., Liu, Y., Bentley, W. E., Payne, G. F. Orthogonal Enzymatic Reactions for the Assembly of Proteins at Electrode Addresses. Langmuir. 25, 338-344 (2008).
- Cheng, Y. In situ quantitative visualization and characterization of chitosan electrodeposition with paired sidewall electrodes. Soft Matter. 6, 3177-3183 (2010).
- Cheng, Y. Mechanism of anodic electrodeposition of calcium alginate. Soft Matter. 7, 5677-5684 (2011).
- Wu, L. -. Q. Spatially Selective Deposition of a Reactive Polysaccharide Layer onto a Patterned Template. Langmuir. 19, 519-524 (2003).
- Wu, H. C. Biofabrication of antibodies and antigens via IgG-binding domain engineered with activatable pentatyrosine pro-tag. Biotechnol. bioeng. , 103-231 (2009).
- Shi, X. -. W. Reagentless Protein Assembly Triggered by Localized Electrical Signals. Adv. Mater. 21, 984-988 (2009).
- Shi, X. -. W. Electroaddressing of Cell Populations by Co-Deposition with Calcium Alginate Hydrogels. Adv. Funct. Mater. 19, 2074-2080 (2009).
- de Vos, P., Faas, M. M., Strand, B., Calafiore, R. Alginate based microcapsules for immunoisolation of islet cells. Biomaterials. 27, 5603-5617 (2006).
- Jayakumar, R., Prabaharan, M., Sudheesh Kumar, P. T., Nair, S. V., Tamura, H. Novel chitin and chitosan nanofibers and their biomedical applications. Biotechnol. Adv. 29, 322-337 (2011).
- Cheng, Y. Electroaddressing Functionalized Polysaccharides as Model Biofilms for Interrogating Cell Signaling. Adv. Funct. Mater. 22, 519-528 (2012).
- Meyer, W. L. Chitosan-coated wires: conferring electrical properties to chitosan fibers. Biomacromolecules. 10, 858-864 (2009).
- Fernandes, R., Roy, V., Wu, H. -. C., Bentley, W. E. Engineered biological nanofactories trigger quorum sensing response in targeted bacteria. Nat. Nanotechnol. 5, 213-217 (2010).
- Yi, H. Biofabrication with chitosan. Biomacromolecules. 6, 2881-2894 (2005).
- Liba Benjamin, D., Aranha India, V., Kim, E., Payne Gregory, F. ACS Symposium Series Ch. 4. Renewable and Sustainable Polymers. 1063, 61-71 (2011).
- Koev, S. T. Chitosan: an integrative biomaterial for lab-on-a-chip devices. Lab Chip. 10, 3026-3042 (2010).
- Luo, X. Programmable assembly of a metabolic pathway enzyme in a pre-packaged reusable bioMEMS device. Lab Chip. 8, 420-430 (2008).
- Spinks, G. M. A novel “dual mode” actuation in chitosan/polyaniline/carbon nanotube fibers. Sensor Actuat B-Chem. 121, 616-621 (2007).
- Yi, H. Patterned assembly of genetically modified viral nanotemplates via nucleic acid hybridization. Nano letters. 5, 1931-1936 (2005).
- Kim, E. Redox-cycling and H2O2 generation by fabricated catecholic films in the absence of enzymes. Biomacromolecules. 12, 880-888 (2011).
- Xie, Y., Xu, B., Gao, Y. Controlled transdermal delivery of model drug compounds by MEMS microneedle array. Nanomedicine. 1, 184-190 (2005).
- Odaci, D., Timur, S., Telefoncu, A. A microbial biosensor based on bacterial cells immobilized on chitosan matrix. Bioelectrochemistry. 75, 77-82 (2009).
- Selimoglu, S. M., Elibol, M. Alginate as an immobilization material for MAb production via encapsulated hybridoma cells. Crit Rev Biotechnol. 30, 145-159 (2010).
- Braschler, T., Johann, R., Heule, M., Metref, L., Renaud, P. Gentle cell trapping and release on a microfluidic chip by in situ alginate hydrogel formation. Lab Chip. 5, 553-559 (2005).
- Yang, X. In-Film Bioprocessing and Immunoanalysis with Electroaddressable Stimuli-Responsive Polysaccharides. Adv. Funct. Mater. 20, 1645-1652 (2010).
- Cheong, M., Zhitomirsky, I. Electrodeposition of alginic acid and composite films. Colloid Surface A. 328, 73-78 (2008).
- Tsao, C. Y., Hooshangi, S., Wu, H. C., Valdes, J. J., Bentley, W. E. Autonomous induction of recombinant proteins by minimally rewiring native quorum sensing regulon of E. coli. Metab. Eng. 12, 291-297 (2010).
