Summary
Vi utviklet en programvare-plattform som utnytter Imaris Neuroscience, ImarisXT og MATLAB for å måle endringer i morfologi av en udefinert form hentet fra tre-dimensjonale confocal fluorescens av enkeltceller. Denne romanen tilnærmingen kan brukes til å kvantifisere endringer i cellen form etter reseptor aktivering og representerer derfor en mulig ekstra verktøy for medisiner.
Abstract
De vanligste programvare analyseverktøy tilgjengelig for måling fluorescens bilder er for to-dimensjonale (2D) data som er avhengige av manuelle innstillinger for inkludering og ekskludering av datapunkter, og dataassistert mønstergjenkjenning for å støtte tolkningen og funn av analysen. Det har blitt mer og mer viktig å kunne måle fluorescens bilder konstruert fra tre-dimensjonale (3D) datasett for å kunne fange kompleksiteten av cellulære dynamikk og forstå grunnlaget av cellulær plastisitet innen biologiske systemer. Sofistikert mikroskopi instrumenter har tillatt visualisering av 3D fluorescens bilder gjennom oppkjøpet av multispektrale fluorescens bilder og kraftig analytisk programvare som rekonstruerer bildene fra confocal stabler som deretter gir en 3D-representasjon av de innsamlede 2D-bilder. Avanserte design-baserte stereology metoder har gått fra tilnærmelse og forutsetninger for original modellbasert stereology en selv i komplekse vev seksjoner 2. Til tross for disse fremskritt i vitenskapelige mikroskopi, forblir et behov for en automatisert analytisk metode som fullt utnytter den iboende 3D data for å tillate analyse og kvantifisering av de komplekse forandringer i cellemorfologi, protein lokalisering og reseptor menneskehandel.
Dagens teknikker tilgjengelig for å kvantifisere fluorescens bilder inkluderer Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) og Image J (NIH) som gir manuell analyse. Imaris (Andor Technology, Belfast, Nord-Irland) programvare gir funksjonen MeasurementPro, som gjør at manuell oppretting av målepunkter som kan plasseres i et volum bilde eller trukket på en rekke 2D skiver for å lage et 3D-objekt. Denne metoden er nyttig for enkelt-klikk punktmålinger å måle en linje avstand mellom to objekter, eller for å opprette et polygon som omslutter et område av interesse, men det er vanskelig å anvende på komplex mobilnettverk strukturer. Filament Tracer (Andor) tillater automatisk deteksjon av 3D neuronale filament-lignende har imidlertid dette modul blitt utviklet for å måle definerte strukturer som nevroner, som er omfattet av dendritter, axoner og spines (tre-lignende struktur). Denne modulen er sinnrikt utnyttes til å lage morfologiske målinger til ikke-neuronale celler 3 imidlertid utdata gir informasjon av et utvidet mobilnettet ved hjelp av en programvare som er avhengig av et definert cellen form snarere enn å være en amorf-formet cellulær modell. For å overvinne problemet med å analysere amorft-formede celler og gjør programvaren mer egnet til en biologisk anvendelse, utviklet Imaris Imaris Cell. Dette var en vitenskapelig prosjekt med Eidgenössische Technische Hochschule, som har blitt utviklet for å beregne forholdet mellom celler og organeller. Mens programvaren muliggjør påvisning av biologiske begrensninger, ved å tvinge en kjerne per celleog ved hjelp av celle membraner å segmentere celler, kan det ikke bli benyttet for å analysere fluorescens data som ikke kontinuerlig fordi ideelt den bygger celleoverflaten uten tomrom. Til vår kunnskap, i dag ingen bruker-modifiserbare automatisert tilnærming som gir morfometrisk informasjon fra 3D fluorescens bilder har blitt utviklet som oppnår mobilnettet romlig informasjon om en udefinert form (figur 1).
Vi har utviklet en analytisk plattform med Imaris kjerne programvaremodulen og Imaris XT tilkobles MATLAB (Mat Works, Inc.). Disse verktøyene lar 3D måling av celler uten en forhåndsdefinert form og med inkonsekvente fluorescens nettverkskomponenter. Videre vil denne metoden gi forskerne som har utvidet kompetanse i biologiske systemer, men ikke kjennskap til dataprogrammer, for å utføre kvantifisering av morfologiske endringer i celle dynamikk.
Protocol
1. Tredimensjonal morfometriske Analyse av encellede Fenotypiske endringer
- Humane embryoniske nyre (HEK293) celler ble transfektert med hemaglutinin (HA)-merket kortikotropin-frigjørende faktor reseptor-2 (CRF-R2), en G-protein-koblet reseptor (GPCR) som beskrevet tidligere 4, 5.
- Cellene ble ubehandlet (ingen behandling, NT), stimulert med CRF-R2 endogen ligand, kortikotropin-frigjørende faktor, CRF (1 uM, 30 min), eller forbehandlet med en selektiv CRF-R2 antagonist, anti-Sauvagine 30 (AS -30, 1 uM, 30 min) før agonistbehandlingen.
- Cellene ble deretter fiksert, permeabilized og behandlet med anti-HA. CRF-R2 ble visualisert ved hjelp av Alexa 594 nm konjugat anti-mus (IgG 1) antistoff. DAPI ble brukt til å visualisere atomkjerner mitotisk scenen.
- For å begrense eksperimentator subjektivitet, ble de eksperimentelle forholdene ikke kjent før etter bildene ble kjøpt og analysert.
- Vi kjøpte bildes fra faste HEK293 celler ved hjelp av en Plan-apochromat 63x/1.4 olje DIC objektiv og Zeiss LSM 510 META confocal mikroskop koblet til en Samstemt integrert to-foton laser system består av en Verdi-V5 laser og en Mira 900-F laser system.
- Under datainnsamlingen prosessen ble cellene compartmentalized både av multispektral seksjonering, 488 nm, og 790 nm (~ 350 nm 2PH Ex.) Og z-partisjonering (0,5 mikrometer trinn) for å inkludere data fra kjernefysiske membranen til den ytre ekstracellulære reseptor ekstremiteter.
- De fluorescens data ble først behandlet ved hjelp Imaris, som tillater visualisering og segmentering av 3D mikroskopi datasett, og en 3D-modell består av kubikk voksler ble opprettet for morfometrisk analyse.
Deretter ble Imaris XT modul brukt til grensesnittet Imaris med MATLAB dataprogram språk å bestemme stedet koordinatene til GPCR utvidelser.
Å ta hensyn til mobilnettet variasjon, fikk vi og analysert fluorescens bilder takno fra 22 celler: ingen behandling (NT) (n = 7), agonist (CRF) behandling (n = 8) og forbehandling med antagonist (AS-30) før agonist behandling (n = 7) (figur 2) .- Regionen of Interest (ROI) bør inkludere en celle som ikke er i aktiv mitotisk scenen og ikke nær til andre celler. På denne måten, vil analysen inkluderer celler med bare en kjerne og de reseptor utvidelser ikke opprørt av nærhet av andre celler.
- Mobilnettet 3D-struktur ble først rekonstruert fra multispektrale fluorescens data ved hjelp av Imaris (v.7.1.1).
- Etter algoritmen designet av Imaris, ble først overflateteknikk rendring utnyttet å representere den kjernefysiske membran. Imaris vil avgjøre om det er mer enn én kjerne i ROI.
- Da flekker-etableringen algoritmen ble brukt til å finne CRF-R2 forlengelse. Spots påvisning ble utnyttet fordi det kompenserer for bakgrunnsstøy og uregelmessig intensitetkomplekse nettverk av amorft-formede celler.
- For å maksimere inkludering av hver enhet av fluorescens deteksjon av CRF-R2, ble flekkene 'diameter satt til 0,2 um, noe som er den minste enhet i bildet å ekstrapolere distinkte informasjon i form av en målt intensitet ved hjelp av en Gaussisk filter. Spot filtrering ble innlemmet i flekker automatiserte prosessen. Programvaren, imidlertid gir brukeren fleksibilitet til å bruke filtre som definerer parametrene.
- For å unngå data trunkering ble datasettet konvertert fra 8-bit (unsigned) fast punkt, 32-bit desimaltall.
- De voxel intensiteter data ble vekslet til øye koordinater data ved hjelp Imaris XT modul tilkobles med MATLAB og den nøyaktige romlige plasseringen av hver flekk ble bestemt ved å utføre en avstand transformasjon med kjernefysiske membranen som et referansepunkt (Figur 3).
- Resultatdataene kan kvantifiseres og presenteres i grafisk format for statistical analyse. Sammenligninger mellom grupper ble utført med to-veis ANOVA og Bonferroni posttest. Data er presentert som gjennomsnitt ± SD. Forskjeller anses signifikant på * p <0,05. Beregninger ble gjort med GraphPad Prism 5,02 (figur 4).
2. Representant Resultater
Å demonstrere makt i vår tilnærming, tallfestet vi celleforandringer som følge av samspillet av G protein-koblede reseptorer (GPCRs) og corticotropin slippe faktor reseptor-2 (CRF-R2) med sin endogent ligand CRF i transfekterte HEK293 celler.
Vi viser at CRF-R2 reseptorer finnes i plasmamembranen og projisere fra avgrensede regioner av membranen av cellene (figur 2A og film 1). Bruk av konvensjonell 2D-analyse, er det mulig å oppdage denne undergruppe av ekstracellulære CRF-R2 reseptorer bare hvis vi analysere reseptor vedheft points på glasset dekker. Derfor mister vi all annen informasjon hentet fra Z-stablet multispektrale data (figur 5).
Når cellene blir behandlet med CRF, er de ekstracellulære reseptorer sterkt redusert, som vist ved reduksjon i avstand av flekker fra plasmamembranen. De er også distribueres fra primært endelige steder i et antall diskrete steder (figur 2B og Film 2).
Effekten av CRF på reseptor membran distribusjon er forhindret ved forbehandling med CRF-R2 spesifikk antagonist, 30 antisavagine (AS-30) og vi finner at CRF-R2 utvidelser ikke endrer (figur 2C og film 3).
Den distale fordeling av flekker, er tegnet inn i de 5 mikrometer spektrum-fargekodede intervaller, utnyttes til å visualisere avstanden av voksler fra kjernekraftverket membran. Ingen behandling og antagonist pretreatment (AS-30, en mM 30 min) før agonist behandling (CRF, en pM, 30 min) viser ingen signifikante (ns) forskjell i GPCR sammentrekning. Behandling av cellene med agonisten (CRF, 1 uM, 30 min) reduserer gradvis antallet CRF-R2-holdige voksler sammenlignet med ingen behandling, 0-5 mikrometer (NS), 6-15 mikrometer (** p < 0,01) og> 15 mikrometer (*** p <0,005), eller sammenlignet med AS-30 behandling, 0-10 mikrometer (NS), 11-15 mikrometer (** p <0,01) og> 15 mikrometer (*** p <0,005) (figur 4).
Figur 1. Diagram av dagens tilgjengelige teknikker og deres begrensning å analysere fluorescens bilder. Klikk her for å se større figur .
Figur 3. 3D-modell av HEK293 transfekterte celler med HA-CRF-R2 rekonstruert fra CLS bilder ved hjelp av Imaris programvare. Surface gjengivelse av kjernen og flekker etableringen beskriver GPCR utvidelser konvertert til små blemmer. De fluorescens data ble først behandlet ved hjelp Imaris som gjør at visualisering og segmentering av 3D mikroskopi datasettet. Deretter ble Imaris XT brukt til grensesnittet Imaris med MATLAB. De voxel intensiteter ble utvekslet iflekk koordinater. Flekkene spektrum-kodet farge (blå 0-5 mikrometer, grønn, 6-10 mikrometer, gule 11-15 mikrometer og røde> 15 mikrometer) representerer avstand skjemaet kjernefysiske membranen. Skalere 5 mikrometer.
Figur 4. Grafisk representasjon av den distale fordelingen av flekker plottet i spektrum-fargekodet 5 mikrometer intervaller utnyttes for å visualisere avstanden av voksler fra kjernekraftverket membran. Ingen behandling og forbehandling med en antagonist (AS-30, 1 uM, 30 min) før agonistbehandlingen (CRF, 1 uM, 30 min) viser ingen signifikant (ns) forskjell i GPCR sammentrekning. Behandling av cellene med agonist (CRF, 1 uM, 30 min) reduserer gradvis avstanden av antall CRF-R2-holdige voksler sammenlignet med ingen behandling 0-5 mikrometer (ns), 6-15 mikrometer (** p <0,01) og> 15 mikrometer (*** p <0,005), eller AS-30 behandling 0-10 mikrometer (ns), 11-15 um (** p <0,01) og> 15 um (*** p <0,005).
Figur 5. Begrensning av 2D morfometrisk analyse av HEK 293 transfekterte celler med HA-CRF-R2. Den midtplan seksjonen av celler (3-4μm ovenfor dekkglass) viser midten av kjernene visualisert med DAPI og HA-CRF-R2 probet ved hjelp av anti-HA og visualisert ved Alexa 488nm konjugert anti-mus (IgG 1) sekundær antistoff og ervervet med CLS viser ingen forskjell mellom (A) ingen behandling (NT) og (B) agonist (CRF, 1 uM, 30 min), mens reseptor adhesjon poeng er dramatisk forskjellige.
Movie 1. Fritt roterende 3D-modellen i "overgå" modus av HEK 293 transfekterte celler med HA-CRF-R2, ingen behandling, for å evaluere mobilnettet fenotype forskjeller mellom reseptor proteiner. Målestokk 5-20 mikrometer./ Files/ftp_upload/4233/4233movie1.avi "target =" _blank "> Klikk her for å se filmen.
Movie 2. Fritt roterende 3D-modellen i "overgå" modus av HEK 293 transfekterte celler med HA-CRF-R2, agonist behandling, CRF (CRF, en pM, 30 min) vurdere cellulære fenotype forskjeller mellom reseptor proteiner. Målestokk 5-20 mikrometer. Klikk her for å se filmen.
Film 3. Fritt roterende 3D i "Surpass" modus av HEK 293 transfekterte celler med HA-CRF-R2, forbehandling med en antagonist (AS-30, 1 uM, 30 min) før agonistbehandlingen (CRF, 1 uM, 30 min ) for å evaluere cellulære fenotype forskjeller mellom reseptor proteiner. Målestokk 5-20 mikrometer. Klikk her for å se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi viste at CRF behandling induserte en betydelig endring i morfologi og plassering av CRF-R2. Endringen i CRF-R2 ble hemmet ved selektiv antagonist. Vi viste at reseptor modifikasjoner som ikke ble oppdaget og kan ikke måles med standard 2D multispektrale teknikker. Evnen til å studere komplekse 3D bilder er kritisk å innlemme kompleksiteten av biologiske parametre for morfometrisk analyse. Vi var i stand til å lage 3D-målinger av celler uten en forhåndsdefinert form med inkonsekvent fluorescens nettverkskomponenter. Vår suite av bruker-modifiserbare automatiserte metoder gjør oss i stand til å kvantifisere molekylære dynamikk i individuelle amorfe-formede celler i sitt miljø for å trekke ut informasjon om celle dynamikk. Dette verktøyet kan bidra til å gjøre forutsigelser om virkningene av en farmakologisk sammensatt på mobilnettet trasé og mobilnettet morfologi endring i nærvær av hemmere og gi informasjon om celle overlevelse.
Fordelen med vår 3D kvantifisering metoden er at den gir forskere med bred kompetanse i biologi mekanismer, men ikke er kjent med datamaskinen koder, til grensesnitt mikroskopi teknikker med dataprogrammer. Vi gjorde encellede målinger for å avdekke informasjon som reflekterer en populasjon av celler 6. Encellede måling gir oss en analyse av en kompleks formet celle uaffisert av nærhet med andre celler. Denne metoden vil hjelpe forskere i å undersøke endringer i cellen form og plassering av membran-bundet proteiner etter kjemisk stimualtion 7, 8. Analysen av en celle skal inneholde data fra mobilnettet indre kjerne avdelinger til sine ekstracellulære ekstremiteter. Maksimal data inkludering som kan fås fra et 2D-bilde er over midtplan av en celle, men er kjernen og den ytterste plasseringen av plasmamembranen plassert på forskjellige z-fly; 2D visualisering avkorterbilde. Som kjernen ligger mellom 3 og 4 mikrometer over cellulære adhesjonsreseptorer punkter, som er plassert på dekkglass, blir en utvidet mengde data tapt. Denne reseptoren romlig omorganisering kan bare sees i 3D-bilder, og er ikke i stand til å bli kvantifisert uten analysen. Dette verktøyet gir en ny tilnærming for å visualisere og måle celleforandringer som ikke oppdages ved hjelp av tradisjonelle 2D analytiske teknikker, og gir informasjon som løser mobilsystemet som helhet i stedet for fragmentert av 2D data. Denne tilnærmingen til måling enkeltceller sammen med andre som er beskrevet teknologier 9, tillater oss å undersøke kompleksiteten i mobilnettet dynamikk og grunnlaget for mobilnettet plastisitet.
Denne metoden er ikke begrenset til Imaris og kan brukes på alle data visualisering programvare integrert med databehandling språk programvare. Fremtidige forbedringer i systemet vil omfatte morfometrisk analyse av 3D celler tatt fra levendeceller for å tillate undersøkelse av hele cellen i sin naturlige tilstand uten kjemisk fiksering eller kjemisk farging. Innhente bilder av levende celler vil også eliminere intercellulære variabilitet, siden vi kan kvantifisere fenotypiske målinger i samme celle over tid.
Vi tror vår plattform-teknologi, med dens potensial til å måle strukturer av uspesifisert formet-celler, vil hjelpe andre forskere til å fylle et tomrom i kvantifisering imaging teknikker. Dette ny tilnærming gjelder karakterisering av tallrike encellete fenotypiske endringer, gjør denne cellebasert assay, som andre encellede profilering 10, et ytterligere verktøy for stoffet funnet prosessen. Siden cellemorfologi har allerede blitt benyttet i high-throughput screening for å identifisere små molekyl-inhibitorer 11, som denne plattformen utvikler seg, forventer vi denne metoden til å være nyttig for å bestemme en dose-respons-kurve fra enkeltceller som påvirker samme pharmacological mål, men med ulike virkningsmekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Biologisk Imaging Development Center (BIDC) University of California, San Francisco for bruk av Imaris, Imaris XT og Matlab. Vi takker V. Kharazia for teknisk assistanse og AT Henry, LK Floren, L. Daitch for deres bidrag til redigeringen av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra staten California Medical Research on Alcohol & Substance Abuse gjennom UCSF til SEB, National Institutes of Health: 1R21DA029966-01 og NIH Fast Track award å skjerme MLSMR samlingen til SEB, UCSF School of Pharmacy ( Dean kontor og klinisk farmasi) og School of Medicine (Clinical Pharmacology & Experimental Therapeutics) til CLHK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human Embryonic Kidney (HEK293) | American Type Culture Collection | CRL-1573 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11965118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | SH30070.03 | |
| AlexaFluor-488 (IgG2b) | Invitrogen | A-11001 | |
| monoclonal anti-HA.11 (IgG1) | Covance | 16B12 | |
| DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| CRF | Sigma | C2917 | |
| Antisauvagine-30 (AS-30) | Sigma | A4727 |
References
- West, M. J. Design-based stereological methods for counting neurons. Prog, Brain Res. 135, 43-51 (2002).
- Burke, M., Zangenehpour, S., Mouton, P. R., Ptito, M. Knowing what counts: unbiased stereology in the non-human primate brain. J. Vis. Exp. (27), e1262 (2009).
- Sugawara, Y., Ando, R., Kamioka, H., Ishihara, Y., Honjo, T., Kawanabe, N., Kurosaka, H., Takano-Yamamoto, T., Yamashiro, T. The three-dimensional morphometry and cell-cell communication of the osteocyte network in chick and mouse embryonic calvaria. Calcif. Tissue Int. 88, 416-424 (2011).
- Vickery, R. G., von Zastrow, M. Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J. Cell Biol. 144, 31-43 (1999).
- Bartlett, S. E., Enquist, J., Hopf, F. W., Lee, J. H., Gladher, F., Kharazia, V., Waldhoer, M., Mailliard, W. S., Armstrong, R., Bonci, A. Dopamine responsiveness is regulated by targeted sorting of D2 receptors. Pro.c Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 11521-11526 (2005).
- Gordon, A., Colman-Lerner, A., Chin, T. E., Benjamin, K. R., Yu, R. C., Brent, R. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nat. Methods. 4, 175-181 (2007).
- Schock, F., Perrimon, N.
- Pincus, Z., Theriot, J. A. Comparison of quantitative methods for cell-shape analysis. J. Microsc. 227, 140-156 (2007).
- Spiller, D. G., Wood, C. D., Rand, D. A., White, M. R.
- Loo, L. H., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Image-based multivariate profiling of drug responses from single cells. Nat Methods. 4, 445-453 (2007).
- Yarrow, J. C., Totsukawa, G., Charras, G. T., Mitchison, T. J. Screening for cell migration inhibitors via automated microscopy reveals a Rho-kinase inhibitor. Chem. Biol. 12, 385-395 (2005).
