プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更
Summary
我々は、遺伝的に非ウイルスを用いて導入遺伝子を持つプライマリヒトT細胞を変更する方法を説明します<em> piggyBac</em>トランスポゾンシステム。 T細胞は、使用して変更された<em> piggyBac</em>トランスポゾンシステムは安定した導入遺伝子の発現を示す。
Abstract
piggyBacトランスポゾンシステムはもともとキャベツルーパー蛾1,2から派生した、自然にアクティブになります。この非ウイルス系は、最も一般的に1はpiggyBacトランスポサーゼ酵素と遺伝子導入活性に必要な逆方向反復要素の間に目的の遺伝子（複数可）を保有するプラスミド、トランスポゾンを発現する2つのプラスミドを利用して、ベースのプラスミドである。PiggyBacを媒介遺伝子転移は通っトランスポザーゼは、目的の標的細胞（S）のゲノムにトランスポゾンセグメントを統合することにより"カット＆ペースト"メカニズムは。PiggyBacは 3-5哺乳類昆虫1,2、多種多様で効率的な遺伝子送達活性を示した、としているプライマリーヒトT細胞を含むヒトの7,8 cells6。最近では、非常に活発piggyBacのトランスポザーゼは、遺伝子導入効率を向上させる9,10生成されました。
ヒトTリンパ球は、臨床intereであるがん11の養子免疫療法のst。注目すべきは、 眠れる森の美女のトランスポゾンシステムを用いて、ヒトT細胞のトランスポゾンの修正を含む最初の臨床試験は、12を承認されています。我々は以前に、ヒトT細胞の遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論としてpiggyBacの有用性を評価した。我々は、レポーター遺伝子と非免疫原性誘導自殺遺伝子7とヒトT細胞の遺伝子改変で効率的であることがpiggyBac発見。ゲノム組み込み部位の解析では、既知の癌原遺伝子13内又はその付近の統合のための好みの欠如を明らかにした。我々は、腫瘍抗原、HER2に対して向けられたキメラ抗原受容体を運ぶために細胞傷害性Tリンパ球の遺伝子変更するpiggyBac使用され、遺伝子改変T細胞は、同所性マウスモデルにおいて、in vitroおよび in vivo でのHER2陽性腫瘍細胞の死滅標的媒介ことがわかった14。我々はまた、piggyBacを使用していたラパマイシンは15を利用されている癌治療に有用であるはずであるラパマイシンに耐性のヒトT細胞を生成します。
ここで、我々は、遺伝的に一次ヒトT細胞を変更するpiggyBacを使用するための方法を説明します。これは、文化、遺伝子改変し、T細胞の活性化に続いてヒト血液から末梢血単核細胞（PBMC）の単離を含む。このレポートの目的は、T細胞は、フローサイトメトリーによる遺伝子発現の解析と定量化のためのレポーター遺伝子（EGFP）で修飾した。
PiggyBacは、関心のある遺伝子の様々なヒトT細胞を変更するために使用することができます。我々は腫瘍抗原14〜T細胞に指示するpiggyBac使用しましたが、我々はまた、7を必要に応じて遺伝子改変された細胞を排除するために、誘導の安全スイッチを追加するpiggyBac使用しています。 piggyBacの大型貨物の容量も遺伝子導入が可能になりました大ラパマイシン耐性のmTOR分子（15キロバイト）15。したがって、我々は様々な目的のための主要なヒトT細胞の安定した遺伝子改変のための非ウイルス性の方法論を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載の方法は、一次ヒトTリンパ球の安定した導入遺伝子の改変を可能にします。我々は以前に、レポーター遺伝子（4週間以上）、非免疫原性の自殺遺伝子、養子免疫療法のためのキメラ抗原受容体（100日以上）を発現するT細胞を変更するpiggyBacトランスポゾンシステムの使用をテストしたと免疫抑制薬7,13-15に対する耐性をエンジニアに。養子免疫療法と他のアプ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SSはTBMMプログラムを通じて卒業生のトレーニンググラントにHHMIメッドによって部分的にサポートされています。厚生省は、退役軍人省からキャリア開発賞と博士夫妻ハロルド·M·Selzmanの寛大な支援によって部分的にサポートされています。この作品はまた、NIHリンパ腫SPORE助成P50CA126752とNIH R01 DK093660によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Lympholyte | Cedarlane | CL5015 | |
| Advanced RPMI 1,640 | LifeTechnologies | 12633020 | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3008803 | |
| GlutaMAX-I Supplement | LifeTechnologies | 35050-061 | |
| Human IL-15 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8159 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Amaxa Nucleofector | Lonza | AAD-1001S | |
| Human T Cell Nucleofector Kit | Lonza | VPA-1002 | |
| CD8-APC | Southern Biotech | 9536-11 | |
| Anti-Human CD3 | eBioscience | 16-0037-81 | |
| Anti-Human CD28 | BD Pharmingen | 555725 | |
| 24 Well Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 24 Well Non Tissue Culture Treated Plate | BD Falcon | 351147 | |
| Complete T cell media composition 1x Advanced RPMI 1,640 5% Heat Inactivated Fetal Bovine Serum 2 mM GlutamaxIM-I |
References
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