Glycaan Profilering van Plant celwandpolymeren met behulp van Microarrays
Summary
Genaamd Een techniek<strong> C</strong> Omprehensive<strong> M</strong> Icroarray<strong> P</strong> Olymer Profiling (CoMPP) voor de karakterisering van plantencelwand glycanen wordt beschreven. Deze methode combineert de specificiteit van monoklonale antilichamen gericht tegen bepaalde epitopen-glycan met een miniatuur microarray analyse platform zodat screening van glycan voorkomen in een breed scala aan biologische context.
Abstract
Plant celwanden zijn complexe matrices van heterogene glycanen die een belangrijke rol in de fysiologie en ontwikkeling van planten te spelen en bieden de grondstoffen voor de menselijke samenleving (bv hout, papier, textiel en biobrandstof-industrie) 1,2. Echter, het begrijpen van de biosynthese en functie van deze componenten blijft uitdagend.
Celwand glycanen zijn chemisch en conformationeel gevarieerd vanwege de complexiteit van hun bouwstenen, de glycosyl residuen. Deze vormen bindingen op meerdere posities en verschillen in ringstructuur isomere of anomere configuratie, en bovendien zijn gesubstitueerd met een array van niet-suikerresten. Glycaan samenstelling varieert in verschillende cel-en / of weefseltypen of subgebieden van een celwand 3. Bovendien is de samenstelling ook aangepast tijdens de ontwikkeling 1 of in reactie op omgevingsfactoren 4.
In exproces van 2.000 genen Plant celwanden zijn complex arrays heterogene glycanen voorspeld betrokken bij celwand glycan biosynthese en modificatie in Arabidopsis 5. Echter, relatief weinig biosynthetische genen functioneel 4,5 gekarakteriseerd. Reverse genetics benaderingen moeilijk omdat de genen vaak differentieel tot expressie, vaak op lage niveaus tussen celtypes 6. Ook zijn mutant studies vaak belemmerd door gen redundantie of compenserende mechanismen om te zorgen voor passende celwand functie is 7 gehandhaafd. Zo nieuwe benaderingen nodig zijn om snel te karakteriseren van de uiteenlopende glycaanstructuren en functionele genomica gebaseerde benaderingen bevorderen om te begrijpen celwand biosynthese en modificatie.
Monoklonale antilichamen (mAbs) 8,9 naar voren zijn gekomen als een belangrijk instrument voor het bepalen van glycan structuur en de verdeling in planten. Deze herkent distInCT epitopen aanwezig in grote klassen van plantencelwand glycanen, met inbegrip van pectines, xyloglucanen, xylanen, mannanen, glucanen en arabinogalactans. Onlangs het gebruik uitgebreid tot grootschalige screening experimenten om de relatieve abundantie van glycanen bepalen in een breed scala van planten en weefseltypes tegelijkertijd 9,10,11.
Hier wordt een microarray gebaseerde glycan screening methode genaamd Comprehensive Polymer Microarray Profiling (CoMPP) (figuren 1 en 2) 10,11 die meerdere monsters kan (100 sec) worden gescreend met een geminiaturiseerde microarray platform met beperkte reagens en monstervolumes. De plek signalen op de microarray kan formeel worden gekwantificeerd aan semi-kwantitatieve gegevens over glycan epitoop optreden te geven. Deze benadering is geschikt voor het bijhouden glycan veranderingen in complexe biologische systemen 12 en een globaal overzicht van celwandsamenstelling bijzonder wanneer voorkennis of deze niet beschikbaar is.
Protocol
Representative Results
Discussion
CoMPP is een snelle en gevoelige werkwijze voor het profileren van de glycan samenstelling van honderden plantaardige monsters in een paar dagen. Deze methode aanvulling op de reeds beschikbare bacteriën of zoogdiercellen glycan matrix platforms voor high-throughput screening van koolhydraat interacties met glycan-binding zoals lectines, receptors en antilichamen 16. Met een grote verscheidenheid van probes voor het detecteren celwand glycanen, is het mogelijk om gedetailleerde informatie te krijgen over gly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IEM wil graag de Deense Raad voor Onderzoek (FTP en FNU) bevestigt de voor financiering. ERL erkent de steun van een ARC DP subsidie. AB erkent de steun van het ARC Centre of Excellence in Plant Cell Walls subsidie.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 3 mm Tungsten Carbide beads | Qiagen | 69997 | |
| Collection microtubes (1.2 mm) | Qiagen | 19560 | 1.5 ml microfuge tubes can also be used |
| Qiagen TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
| 3 mm glass beads | Sigma Aldrich | Z143928 | |
| CDTA | Sigma Aldrich | 34588 | |
| Cadmium oxide | Sigma Aldrich | 202894 | |
| 1,2-diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550 | |
| Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) | GE-water & process technologies | EP2HY00010 | different pore sized membranes are suitable for different pin types |
| Xact II microarrayer robot | Labnext | 001A | the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached |
| Xtend RM microarray pins | Labnext | 0037-350 | pins must be suitable for spotting on membranes |
| 384 well microtiter plates (polypropylene) | Greiner | 781207 | |
| Anti-glycan monoclonal antibodies | Plant Probes/ CarboSource/Biosupplies |
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au). | |
| Anti-Rat IgG (whole molecule) – Peroxidase antibody produced in goat. | Sigma | A9037 | the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc). |
| SIGMAFAST 3,3′-Diaminobenzidine tablets | Sigma | D4293 | the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent). |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermoscientific | 34080 | see above |
| Xplore Image Processing Software | LabNext | 008 | many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots. |
| Plant polysaccharides | Sigma/Megazyme |
References
- Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
- Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
- Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
- Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
- Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
- Sarria, R., Wagner, T. A., O’Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
- Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
- Willats, W. G. T., Knox, J. P., Rose, J. K. C. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. , 92-110 (2003).
- Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
- Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
- Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
- Moller, I. E., Licht, D. e. F. i. n. e., Harholt, H. H., J, , et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6 (3), e17506 (2011).
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. , (2012).
- Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
- Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
- Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. , (2011).
- McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
- Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
- Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
- Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
- 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
- Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).
- Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
- Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
- Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).
