Oppdragelse og Injeksjon av<em> Manduca sexta</em> Larver å vurdere Bakteriell Virulence
Summary
Metoden beskrevet her utnytter direkte injeksjon av entomopathogenic bakterier i hemocoel av<em> Manduca sexta</em> Insektlarver.<em> M. sexta</em> Er en kommersielt tilgjengelig, og godt studert insekt. Dermed representerer denne metoden en enkel tilnærming til å analysere host-bakterielle interaksjoner fra perspektivet til en eller begge parter.
Abstract
Manduca sexta, kjent som tobakk hornworm, regnes som en betydelig landbruket pest, fôring på solanaceous planter inkludert tobakk og tomat. Mottakelighet M. sexta larver til en rekke entomopathogenic bakteriearter 1-5, samt mengde informasjon tilgjengelig om insekt immunforsvar 6-8, og den ventende genomsekvens 9 gjør det til en god modell organisme for bruk i å studere vert-mikrobe interaksjoner under patogenesen. I tillegg, M. sexta larver er relativt store og lett å manipulere og vedlikeholde i laboratoriet i forhold til andre mottakelige insektarter. Sin store størrelse forenkler også effektiv vev / hemolymph ekstraksjon for analyse av verten respons til infeksjon.
Metoden som presenteres her beskriver direkte injeksjon av bakterier inn i hemocoel (blod hulrom) av M. sexta larver. Denne tilnærmingenkan brukes til å analysere og sammenligne virulens egenskapene til ulike bakteriearter, stammer, eller mutanter ved å overvåke tid til insekt død etter injeksjon. Denne metoden ble utviklet for å studere patogenitet av Xenorhabdus og Photorhabdus arter, som vanligvis forbinder med nematode vektorer som et middel for å få innpass i insekt. Entomopathogenic nematoder typisk infisere larver via naturlige fordøyelsesenzymer eller respiratoriske åpninger, og slipper sin symbiotiske bakterier innholdet i insekt hemolymph (blod) kort tid etterpå 10. Injeksjonen metoden beskrevet her omgår behovet for en nematode vektor, dermed frakobling virkningene av bakterier og nematode på insekt. Denne metoden tillater for nøyaktig telling av smittefarlig materiale (celler eller protein) innenfor inokulatet, som ikke er mulig ved hjelp av andre eksisterende metoder for å analysere entomopathogenesis, herunder sammenpressing 11 og oral toksisitet analysene 12 <em>. Også oral giftighet analyser adressere virulens skilles giftstoffer introdusert i fordøyelsessystemet av larver, mens den direkte injeksjon metode løser virulens av hel-celle inokula.
Nytten av den direkte injeksjon metoden som er beskrevet her, er å analysere bakteriell patogenesen ved å overvåke insekt dødelighet. Imidlertid kan denne metoden enkelt utvides for anvendelse i å studere effekten av infeksjon på M. sexta immunsystem. Insektet reagerer smitte via både humorale og cellulære responser. Humoral respons omfatter anerkjennelse av bakteriell-assosierte mønstre og påfølgende produksjon av ulike antimikrobielle peptider 7; uttrykket av gener som koder for disse peptidene kan overvåkes etter at direkte smitte via RNA ekstraksjon og kvantitativ PCR 13. Den cellulære responsen til infeksjon innebærer nodulation, innkapsling og fagocytose av smittestoffer ved hemocytes 6 </sup>. Å analysere disse responser, kan injiseres insekter bli dissekert og visualisert ved mikroskopi 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den direkte injeksjon av M. sexta larver med entomopathogenic bakterier, som beskrevet her, fungerer som en enkel og effektiv måte å analysere bakteriell virulens. Fremgangsmåten er også svært tilpasningsdyktig for å dekke ulike eksperimentelle fag og / eller tilstander. Bakterier kan være forberedt på ulike måter før injeksjon. I tilfelle av X. nematophila, villtype celler dyrket i næringsrikt Luria-Bertani (LB) medium til midten log fase er vanligvis den mest virulente og drepte de fleste …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke tidligere medlemmer av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, og Youngjin Park for deres bidrag til utviklingen av denne protokollen. Dette arbeidet ble finansiert av National Science Foundation stipend IOS-0950873 og National Institutes of Health NRSA fellesskap FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
