Summary

Criação e injeção de<em> Manduca sexta</em> As larvas para avaliar a virulência bacteriana

Published: December 11, 2012
doi:

Summary

O método descrito aqui utiliza a injecção directa de bactérias entomopatogênicos no hemocelo de<em> Manduca sexta</em> Larvas de insetos.<em> M. sexta</em> É um inseto disponível comercialmente e bem estudado. Assim, este método representa uma abordagem simples para analisar interacções hospedeiro-bacteriana a partir da perspectiva de um ou de ambos os parceiros.

Abstract

Manduca sexta, vulgarmente conhecido como o hornworm tabaco, é considerada uma importante praga agrícola, alimentando-se de plantas solanáceas, incluindo o tabaco e tomate. A susceptibilidade de M. sexta larvas para uma variedade de espécies bacterianas entomopatogênicos 1-5, bem como a riqueza da informação disponível sobre o sistema imunitário do insecto 6-8, e a sequência do genoma pendente 9 torná-lo um organismo modelo bom para ser utilizado no estudo de interacções hospedeiro-microorganismo durante a patogênese. Além disso, M. sexta larvas são relativamente grandes e fáceis de manipular e manter no laboratório relação a outras espécies de insetos suscetíveis. O seu grande tamanho, também facilita a extracção dos tecidos / hemolinfa eficiente para a análise da resposta do hospedeiro à infecção.

O método aqui apresentado descreve a injecção directa de bactérias no hemocelo (cavidade de sangue) de M. larvas sexta. Esta abordagempode ser utilizado para analisar e comparar as características de virulência em várias espécies bacterianas, estirpes ou mutantes, por simplesmente controlar o tempo até à morte de insectos após a injecção. Este método foi desenvolvido para o estudo da patogenicidade de Xenorhabdus Photorhabdus e espécies, que normalmente se associam com os vectores de nematóides como um meio de ganhar a entrada do insecto. Nematóides entomopatogênicos tipicamente infectar larvas através digestivo natural ou aberturas respiratórias, e liberar os seus conteúdos simbióticas bacterianas no inseto hemolinfa (sangue) pouco depois 10. O método de injecção aqui descrito evita a necessidade de um vector nemátodo, assim, desengatar os efeitos das bactérias e nematóides sobre o insecto. Este método permite a enumeração exacta de material infeccioso (células ou proteínas) dentro do inoculo, que não é possível utilizar outros métodos existentes para a análise de entomopathogenesis, incluindo nicking 11 e ensaios de toxicidade oral 12 <em>. Além disso, os ensaios de toxicidade oral abordar a virulência de toxinas segregadas introduzidos no sistema digestivo de larvas, ao passo que o método de injecção directa elimina a virulência dos inóculos de células inteiras.

A utilidade do método de injecção directa, tal como descrito aqui é analisar patogênese bacteriana por monitorização da mortalidade de insectos. No entanto, este método pode ser facilmente expandido para uso no estudo dos efeitos da infecção com o M. sexta sistema imunitário. O insecto responde à infecção por meio de ambas as respostas humoral e celular. A resposta humoral inclui o reconhecimento de bactérias associadas a padrões e subsequente produção de diversos péptidos antimicrobianos 7, a expressão de genes que codificam estes péptidos pode ser monitorizada após a infecção directa através de extração de RNA e PCR quantitativa 13. A resposta celular à infecção envolve nodulação, encapsulamento, e a fagocitose dos agentes infecciosos por hemócitos 6 </sup>. Para analisar estas respostas, insectos injectados podem ser dissecados e visualizadas por microscopia de 13, 14.

Protocol

1. Esterilização ovo do inseto e criação Na preparação de dietas, primeiro autoclave 15 g de agar fornecida em 900-1.000 ml de H 2 O. Imediatamente após a mistura em autoclave, com 166 g de dieta de gérmen de trigo e de mistura bem em um misturador de laboratório. Despeje em um prato (ou pratos) para esfriar, em seguida, transferir dieta para folha de alumínio, enrole firmemente, loja e a 4 ° C. Após a chegada, esterilizar M. Sexta ovos com 250 ml de solução de lix?…

Representative Results

Um exemplo representativo de um ensaio de mortalidade dos insectos é descrito na Figura 3. Nesta experiência, os insectos foram injectados com cerca de 50 unidades formadoras de colónias (CFU) de um ou outro tipo selvagem (ATCC19061) ou uma estirpe mutante atenuada (lrp 13) de Xenorhabdus nematophila crescido a fase mid-log (n = 6 por insectos estirpe). As larvas foram observadas para, aproximadamente, 72 horas, e a percentagem de insectos vivos injectados em cada instant…

Discussion

A injecção directa de M. sexta larvas com bactérias entomopatogênicos, como aqui descrito, serve como um meio simples e eficaz para analisar a virulência bacteriana. O método também é altamente adaptável para se adequar a diferentes sujeitos experimentais e / ou condições. As bactérias podem ser preparados de várias maneiras, antes da injecção. No caso de X. nematophila, células selvagens cultivadas em rico em nutrientes Luria-Bertani (LB) até meados de log-fase são tipicamente o mais…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer aos membros anteriores do laboratório Goodrich-Blair: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, e Youngjin Parque por suas contribuições para o desenvolvimento deste protocolo. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation concessão IOS-0950873 e os Institutos Nacionais de Saúde NRSA comunhão FAI084441Z.

Materials

Reagent Company Catalogue number Comments
90 mm filter paper Whatman 1001 090  
Glass filter holder Millipore XX1004700  
Manduca sexta eggs Carolina Biological Supply 143880  
Gypsy Moth Diet + agar MP Biomedicals 0296029301  
5.5 oz. plastic containers and lids Solo Cup Company URC55-0090 Pl4-0090  
1 oz. plastic containers and lids DART Container Corporation 100PC 100PCL25  
1x PBS     137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4
Syringe Hamilton 80208 30 gauge, 0.375″ length, point style 2

References

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Cite This Article
Hussa, E., Goodrich-Blair, H. Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence. J. Vis. Exp. (70), e4295, doi:10.3791/4295 (2012).

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