Uppfödning och Injektion av<em> Manduca sexta</em> Larver att bedöma bakteriell Virulens
Summary
Den här beskrivna metoden utnyttjar direktinsprutning av entomopatogena bakterier i hemocoel av<em> Manduca sexta</em> Insektslarver.<em> M. sexta</em> Är en kommersiellt tillgänglig och väl studerade insekt. Således representerar denna metod en enkel metod för att analysera värd-bakteriella interaktioner ur ett eller båda parter.
Abstract
Manduca sexta, allmänt känd som tobak hornworm, anses vara en betydande jordbruk skadedjur, äter Solanaceae växter som tobak och tomat. Känsligheten av M. sexta larver till en mängd olika entomopatogena bakteriearter 1-5, samt mängd information som finns tillgänglig om insekten immunförsvar 6-8, och i avvaktan på arvsmassa 9 gör det till en bra modell organism för användning i studier värd-mikrob interaktioner under patogenes. Dessutom, M. sexta larver är relativt stora och lätta att manipulera och underhålla i laboratoriet i förhållande till andra mottagliga insektsarter. Sin storlek underlättar också effektiv vävnad / hemolymfa utvinning för analys av värdens svar på infektion.
Den metod som presenteras här beskriver direkt injektion av bakterier i hemocoel (blod hålighet) av M. sexta larver. Detta tillvägagångssättkan användas för att analysera och jämföra virulensen hos olika bakteriella arter, stammar eller mutanter genom att helt enkelt övervaka tiden till död insekt efter injektion. Denna metod har utvecklats för att studera sjukdomsalstrande Xenorhabdus och Photorhabdus arter, som normalt förknippar med nematod vektorer som ett sätt att få tillträde till insekten. Entomopatogena nematoder infektera normalt larver genom naturlig matsmältningssystemet eller respiratoriska öppningar, och släppa sina symbiotiska bakterier innehåll i insekten hemolymfa (blod) kort därefter 10. Injektionen här beskrivna metoden kringgår behovet av en nematod vektor, vilket frikoppling effekterna av bakterier och nematod på insekten. Denna metod tillåter en exakt räkning av infektiöst material (celler eller protein) i inokulatet, vilket inte är möjligt med andra befintliga metoder för analys entomopathogenesis inklusive nicking 11 och muntliga analyser toxicitet 12 <em>. Dessutom, oral toxicitet analyser behandla virulensen hos utsöndrade toxiner som förs in i matsmältningssystemet av larver, medan den direkta injektion metod behandlar virulens av helcells-inokulat.
Användbarheten av direkt insprutning metoden som beskrivs här är att analysera bakteriell patogenes genom övervakning insekt dödlighet. Emellertid kan denna metod lätt utvidgas för användning vid studier av effekterna av infektion på M. sexta immunsystem. Insekten svarar på infektion via både humorala och cellulära svar. Det humorala svaret innefattar erkännande av bakteriell-associerade mönster och efterföljande produktion av olika antimikrobiella peptider 7, uttrycket av gener som kodar för dessa peptider kan övervakas efter direkt infektion via RNA-extraktion och kvantitativ PCR 13. Det cellulära svar på infektion innebär nodulation, inkapsling och fagocytos av smittämnen som hemocyter 6 </sup>. För att analysera dessa svar kan injiceras insekter kan dissekeras och visualiseras genom mikroskopi 13, 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den direkta injektionen av M. sexta larver med entomopatogena bakterier, som beskrivs här, fungerar som ett enkelt och effektivt sätt att analysera bakteriell virulens. Metoden är också mycket anpassningsbar för att passa olika försökspersoner och / eller förhållanden. Bakterier kan framställas på olika sätt före injektion. I fallet X. nematophila, vildtyp celler odlade i näringsrikt Luria-Bertani (LB)-medium till mitten av log-fasen är vanligtvis den mest virulenta, dödar de flesta ell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka tidigare medlemmar av Goodrich-Blair lab: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard och Youngjin Park för deras bidrag till utvecklingen av detta protokoll. Detta arbete har finansierats av National Science Foundation IOS-0950873 och National Institutes of Health NRSA gemenskap FAI084441Z.
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 90 mm filter paper | Whatman | 1001 090 | |
| Glass filter holder | Millipore | XX1004700 | |
| Manduca sexta eggs | Carolina Biological Supply | 143880 | |
| Gypsy Moth Diet + agar | MP Biomedicals | 0296029301 | |
| 5.5 oz. plastic containers and lids | Solo Cup Company | URC55-0090 Pl4-0090 | |
| 1 oz. plastic containers and lids | DART Container Corporation | 100PC 100PCL25 | |
| 1x PBS | 137 mm NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4, pH 7.4 | ||
| Syringe | Hamilton | 80208 | 30 gauge, 0.375″ length, point style 2 |
References
- Bintrim, S. B., Ensign, J. C. Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes. J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).
- Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta. Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).
- Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens. Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).
- Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera). Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).
- Forst, S. A., Tabatabai, N. Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus. Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).
- Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta. Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).
- Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).
- Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus. Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).
- Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila. Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).
- D’Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection. J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).
- Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).
- Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity. Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).
- Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).
- Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila. Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).
- Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects. Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).
- Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination. Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).
- Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus. J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).
- Kavanagh, K., Reeves, E. P. Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens. FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).
