Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier
Summary
Vi beskriver den hurtige isolering af primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) ved flowcytometrisk negativ selektion. Disse AECII viser høj levedygtighed og renhed og er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser af deres rolle i respiratoriske tilstande, såsom autoimmune eller infektiøse sygdomme.
Abstract
Gennem de seneste år har bidraget fra alveolære type II epithelceller (AECII) til forskellige aspekter af immun regulering i lungen i stigende grad blevet anerkendt. AECII har vist sig at deltage i cytokinproduktion i betændte luftveje og også fungere som antigenpræsenterende celler i både infektion og T-cellemedieret autoimmunitet 1-8. Derfor er de særligt interessant også i kliniske sammenhænge, såsom luftvejene hyper-reaktivitet til udenrigs-og selv-antigener samt infektioner, der direkte eller indirekte rettet mod AECII. Men vores forståelse af de detaljerede immunologiske funktioner betjenes af alveolære type II epitelceller i den raske lunge samt i inflammation forbliver fragmentarisk. Mange undersøgelser vedrørende AECII funktion udføres ved anvendelse af muse-eller humane alveolære epitelcellelinier 9-12. Arbejde med cellelinjer sikkert tilbyder en række fordele, såsom tilgængeligheden af et stort antal of celler for omfattende analyser. Vi mener imidlertid, at anvendelsen af primære murine AECII giver en bedre forståelse af den rolle, denne celletype i komplekse processer som infektion eller autoimmun inflammation. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr, der lider af sådanne luftvejssygdomme, hvilket betyder at de har været udsat for alle yderligere ydre faktorer spiller en rolle i den analyserede indstilling. Som et eksempel kan levedygtige AECII isoleres fra mus intranasalt inficeret med influenza A-virus, der primært retter sig mod disse celler til replikation 13. Vigtigere, gennem ex vivo infektion af AECII isoleret fra raske mus, kan undersøgelser af de cellulære reaktioner monteret ved infektion forlænges yderligere.
Vores protokol til isolering af primære murine AECII er baseret på enzymatisk fordøjelse af muselunge efterfulgt af mærkning af den resulterende cellesuspension med antistoffer specifikke for CD11c, CD11, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII derefter identificeret som det umærkede og sideværts spredning høj (SSC høj) cellepopulation og adskilles ved fluorescensaktiveret cellesortering 3.
I forhold til alternative fremgangsmåder til isolering af primære epitelceller fra muselunger, giver vores protokol til flowcytometrisk isolering af AECII ved negativ selektion uberørt, meget levedygtig og ren AECII på forholdsvis kort tid. Derudover og i modsætning til konventionelle fremgangsmåder til isolering ved at panorere og udtømning af lymfocytter via binding af antistof-koblede magnetiske perler 14, 15, tillader flowcytometrisk celle-sortering diskrimination ved cellestørrelse og granularitet. Eftersom instrumentering til flowcytometrisk cellesortering er tilgængelig, kan den beskrevne procedure anvendes ved relativt lave omkostninger. Ved siden af standard-antistoffer og enzymer til lunge disintegration, ingen yderligere reagenser såsom magnetiskperler er nødvendige. De isolerede celler er egnede til en lang række funktionelle og molekylære undersøgelser, som omfatter in vitro-dyrkning og T-celle stimulation assays samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vores protokol til isolering af murine AECII ved flowcytometri tilbyder en hurtig måde at få adgang primære celler fra muselunge for en lang række funktionelle og molekylære studier. Den beskrevne fremgangsmåde giver stærkt levedygtige og rene populationer af AECII som er tilstrækkelige i antal til direkte efterfølgende analyser, såsom RNA-isolering (se figur 2b) og transkriptom undersøgelser. For funktionelle anvendelser er det også muligt at dyrke de isolerede celler, hvilket tillader …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke M. Höxter for teknisk bistand i forbindelse med sortering primær murine AECII fra biosikkerhedsniveau 2 prøver.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den tyske Research Foundation (DFG) til DB (SFB587, TP B12 og BR2221/1-1) og et stipendium fra Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) til AA. DB understøttes af formandens initiativ og netværk Fund af Helmholtz Association of German Research Centers (HGF) under kontrakt nummer W2/W3-029.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
