Citometría de flujo El aislamiento de células primarias murino tipo II alveolares epiteliales de Estudios funcionales y moleculares
Summary
Se describe el aislamiento rápido de células primarias de murino de tipo II alveolares epiteliales (AECII) por citometría de flujo negativo de selección. Estos AECII mostrar una alta viabilidad y pureza, y son adecuados para una amplia gama de estudios funcionales y molecular respecto a su función en condiciones respiratorias tales como enfermedades autoinmunes o infecciosas.
Abstract
A lo largo de los últimos años, la contribución de las células alveolares de tipo II epiteliales (AECII) a diversos aspectos de la regulación inmune en el pulmón se ha reconocido cada vez más. AECII se han mostrado participar en la producción de citoquinas en las vías respiratorias inflamadas y actuar incluso como células presentadoras de antígeno tanto en la infección de células T y la autoinmunidad mediada por 1-8. Por lo tanto, son especialmente interesantes también en contextos clínicos como la hiper-reactividad de las vías respiratorias al exterior y de auto-antígenos, así como infecciones que directa o indirectamente se dirigen AECII. Sin embargo, nuestra comprensión de las funciones inmunológicas detalladas servidos por células alveolares de tipo II epiteliales en el pulmón sano, así como en la inflamación sigue siendo fragmentaria. Muchos estudios sobre la función AECII se realizan a través del ratón o humano líneas de células epiteliales alveolares 9-12. Trabajo con líneas de células sin duda ofrece una serie de beneficios, tales como la disponibilidad de un gran número of células para análisis extensos. Sin embargo, creemos que el uso de AECII murino primaria permite una mejor comprensión de la función de este tipo de células en procesos complejos tales como la infección o inflamación autoinmune. AECII murino primaria se pueden aislar directamente a partir de animales que sufren de tales condiciones respiratorias, lo que significa que han sido objeto de todos los factores extrínsecos adicionales que juegan un papel en el ajuste analizado. Como ejemplo, AECII viable puede ser aislado de ratones por vía intranasal infectadas con virus de influenza A, que se dirige principalmente a estas células para la replicación 13. Es importante destacar que, a través de la infección ex vivo de AECII aislado de ratones sanos, los estudios de las respuestas celulares montados sobre la infección puede ser extendido.
El protocolo para el aislamiento de AECII murino primario se basa en la digestión enzimática del pulmón de ratón seguido de etiquetado de la suspensión celular resultante con anticuerpos específicos para CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 y CD16/CD32. AECII granulares se identifica entonces como la dispersión de alta sin marcar y lateral (SSC alta) población de células y son separadas por fluorescencia de células activadas por la clasificación 3.
En comparación con otros métodos de aislamiento de células epiteliales primarias de los pulmones del ratón, nuestro protocolo de aislamiento de citometría de flujo de AECII por selección negativa produce intacta, altamente viable y puro AECII en tiempo relativamente corto. Además, y en contraste con los métodos convencionales de aislamiento por lavado en batea y el agotamiento de los linfocitos a través de la unión del anticuerpo acoplado-perlas magnéticas 14, 15, de citometría de flujo de clasificación de células permite la discriminación por medio de tamaño de celda y granularidad. Dado que la instrumentación para la clasificación de células por citometría de flujo está disponible, el procedimiento descrito se puede aplicar a costes relativamente bajos. Al lado de anticuerpos estándar y enzimas para la desintegración, pulmón, ausencia de reactivos adicionales tales como magnéticaperlas se requiere. Las células aisladas son adecuadas para una amplia gama de estudios funcionales y moleculares, que incluyen el cultivo in vitro de células T y ensayos de estimulación, así como transcriptoma, proteoma o análisis de secretoma 3, 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo para el aislamiento de murino AECII por citometría de flujo ofrece una forma rápida de acceder a las células primarias del pulmón de ratón para toda una serie de estudios funcionales y moleculares. El procedimiento descrito se obtiene poblaciones altamente viables y puro de AECII que son suficientes en número para directos análisis posteriores, tales como el aislamiento de ARN (ver figura 2b) y transcriptome estudios. Para aplicaciones funcionales, también es posible cultivar las c?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a M. Höxter para la asistencia técnica en la clasificación AECII murino primaria de bioseguridad de nivel 2 muestras.
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Alemana de Investigación (DFG) a DB (SFB587, B12 y BR2221/1-1 TP) y una beca de la Escuela de Investigación Biomédica de Hannover (DFG GSC 108) a AA. DB con el apoyo de la Iniciativa del Presidente y del Fondo de Redes de la Asociación Helmholtz de Centros de Investigación alemán (HGF), bajo contrato W2/W3-029 número.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
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