Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier
Summary
Vi beskriver den raske isolasjon av primære murine type II alveolære epitelceller (AECII) etter flowcytometrisk negativ seleksjon. Disse AECII viser høy levedyktighet og renhet, og er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier innen sin respiratoriske tilstander som autoimmune eller smittsomme sykdommer.
Abstract
Gjennom de siste årene har bidraget fra alveolære type II epitelceller (AECII) til ulike aspekter av immunsystemet regulering i lungene blitt stadig mer anerkjent. AECII har vist å delta i cytokin produksjon i betent luftveier og å selv fungere som antigen-presenterende celler i både infeksjon og T-celle mediert autoimmunitet 1-8. Derfor er de spesielt interessant også i kliniske sammenhenger som luftveiene hyper-reaktivitet til utenriks-og self-antigener og infeksjoner som direkte eller indirekte er rettet mot AECII. Forblir imidlertid vår forståelse av de detaljerte immunologiske funksjoner servert av alveolare type II epitelceller i sunn lunge samt i betennelse fragmentarisk. Mange studier om AECII funksjon utføres ved hjelp av musen eller menneskelige alveolære epitelceller cellelinjer 9-12. Arbeide med cellelinjer tilbyr sikkert en rekke fordeler, slik som tilgjengelighet av store tall of celler for omfattende analyser. Vi tror imidlertid at bruk av primær murine AECII gir en bedre forståelse av hvilken rolle denne celletypen i komplekse prosesser som infeksjon eller autoimmune betennelse. Primær murine AECII kan isoleres direkte fra dyr som lider av slike åndedrettsproblemer, som betyr at de har vært utsatt for alle andre ytre faktorer spiller en rolle i den analyserte innstillingen. Som et eksempel, kan levedyktig AECII isoleres fra mus intranasalt infisert med influensa A virus, som primært er rettet mot disse cellene for replikering 13. Viktigere, gjennom ex vivo infeksjon av AECII isolert fra friske mus, kan studier av cellulære responser montert på infeksjon bli ytterligere utvidet.
Vår protokoll for isolering av primær murine AECII bygger på enzymatisk fordøyelse av musen lunge etterfulgt av merking av den resulterende cellesuspensjonen med antistoffer som er spesifikke for CD11c, CD11b, F4/80,CD19, CD45 og CD16/CD32. Granulære AECII blir deretter identifisert som den umerkede og sideveis scatter høy (SSC høy) cellepopulasjon og atskilles med fluorescens aktivert celle sortering 3.
I forhold til alternative metoder for å isolere primære epitelceller fra mus lungene, gir vår protokoll for flowcytometrisk isolering av AECII etter negativ seleksjon urørt, høyst livskraftig og ren AECII i relativt kort tid. I tillegg, og i motsetning til konvensjonelle metoder for isolering ved å panorere og uttømming av lymfocytter via binding av antistoff-koplede magnetiske kuler 14, 15, tillater flowcytometrisk celle-sortering diskriminering ved hjelp av cellestørrelse og granularitet. Gitt at instrumentering for flowcytometrisk celle sortering er tilgjengelig, kan den beskrevne fremgangsmåte følges ved relativt lave kostnader. Ved siden av standard antistoffer og enzymer for lunge oppløsning, ingen ekstra reagenser som magnetiskperler kreves. De isolerte celler er egnet for et bredt spekter av funksjonelle og molekylære studier, som inkluderer in vitro kultur og T-celle stimulering analyser samt transkriptom, proteom eller secretome analyser 3, 4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vår protokoll for isolering av muse AECII ved strømningscytometri tilbyr en rask måte å få tilgang primærceller fra musen lungene for en hel rekke av funksjonelle og molekylære studier. Den beskrevne prosedyren gir svært levedyktige og rene populasjoner av AECII som er tilstrekkelig i antall for direkte påfølgende analyser, for eksempel RNA isolert (se figur 2b) og transkriptom studier. For funksjonelle anvendelser er det også mulig å dyrke de isolerte celler, slik f.eks generasjon …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke M. Höxter for teknisk assistanse i sortering primære murine AECII fra biosikkerhetsnivå 2 prøver.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den tyske Research Foundation (DFG) til DB (SFB587, TP B12 og BR2221/1-1) og et stipend fra Hannover Biomedical Research School (DFG GSC 108) til AA. DB er støttet av presidentens initiativ og nettverk fond i Helmholtz Association of German Forskning Centers (HGF) under kontrakt nummer W2/W3-029.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| indwelling cannula Introcan 22G | Braun | REF 4252098B | |
| Dispase, 100 ml(5000 caseinolytic units) | BD Biosciences | 354235 | aliquot to 4 ml in 15 ml tubes, store at -20 °C |
| Biozym Plaque Agarose | Biozym | 840101 | 1% w/v in H2O |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, 2000 Kunitz units/vial | Sigma-Aldrich | D4263 | freshly dissolve content of 1 vial in 300 μl DMEM |
| DMEM | Gibco | 22320-022 | used as provided by manufacturer (Low Glucose, Pyruvate, HEPES) |
| cell strainers (100 μm, 75 μm) | BD Falcon | 352360, 352350 | |
| nylon mesh(48 μm, 30 μm) | Bückmann GmbH | 03-48/26-1020, 03-30/18-108 | |
| CellTrics 50 μm filter | PARTEC | 04-0042-2317 | |
| anti-mouse CD16/CD32 | BioLegend | 101302 | clone 93; purified |
| anti-mouse F4/80 | BioLegend | 123116 | clone BM8; APC coupled |
| anti-mouse CD11b | BioLegend | 101208 | clone M1/70; PE coupled |
| anti-mouse CD11c | BioLegend | 117310 | clone N418; APC coupled |
| anti-mouse CD45 | BioLegend | 103102 | clone 30-F11; purified |
| anti-mouse CD19 | eBioscience | 12-0193-83 | eBio 1D3; PE coupled |
| polyclonal goat anti-rat IgG | BD Pharmingen | 550767 | polyclonal, PE coupled |
Antibodies coupled to alternative fluorochromes can be used, depending on the flow cytometer and lasers available. |
References
- Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: defender of the alveolus revisited. Respir. Res. 2, 33-46 (2001).
- Folkerts, G., Nijkamp, F. P. Airway epithelium: more than just a barrier. Trends Pharmacol. Sci. 19, 334-341 (1998).
- Gereke, M., et al. Phenotypic alterations in type II alveolar epithelial cells in CD4+ T cell mediated lung inflammation. Respir. Res. 8, 47 (2007).
- Gereke, M., Jung, S., Buer, J., Bruder, D. Alveolar type II epithelial cells present antigen to CD4(+) T cells and induce Foxp3(+) regulatory T cells. Am. J. Respir. Crit Care Med. 179, 344-355 (2009).
- Gribar, S. C., Richardson, W. M., Sodhi, C. P., Hackam, D. J. No longer an innocent bystander: epithelial toll-like receptor signaling in the development of mucosal inflammation. Mol. Med. 14, 645-659 (2008).
- Herold, S., et al. Alveolar epithelial cells direct monocyte transepithelial migration upon influenza virus infection: impact of chemokines and adhesion molecules. J. Immunol. 177, 1817-1824 (2006).
- Knight, D. A., Holgate, S. T. The airway epithelium: structural and functional properties in health and disease. Respirology. 8, 432-446 (2003).
- Schmiedl, A., Kerber-Momot, T., Munder, A., Pabst, R., Tschernig, T. Bacterial distribution in lung parenchyma early after pulmonary infection with Pseudomonas aeruginosa. Cell Tissue Res. 342, 67-73 (2010).
- Loveday, E. K., Svinti, V., Diederich, S., Pasick, J., Jean, F. Temporal- and Strain-Specific Host MicroRNA Molecular Signatures Associated with Swine-Origin H1N1 and Avian-Origin H7N7 Influenza A Virus Infection. J. Virol. 86, 6109-6122 (2012).
- Marriott, H. M., et al. Interleukin-1beta regulates CXCL8 release and influences disease outcome in response to Streptococcus pneumoniae, defining intercellular cooperation between pulmonary epithelial cells and macrophages. Infect. Immun. 80, 1140-1149 (2012).
- Mata, M., Morcillo, E., Gimeno, C., Cortijo, J. N-acetyl-L-cysteine (NAC) inhibit mucin synthesis and pro-inflammatory mediators in alveolar type II epithelial cells infected with influenza virus A and B and with respiratory syncytial virus (RSV). Biochem. Pharmacol. 82, 548-555 (2011).
- Zarbock, R., et al. The surfactant protein C mutation A116D alters cellular processing, stress tolerance, surfactant lipid composition, and immune cell activation. BMC. Pulm. Med. 12, 15 (2012).
- Taubenberger, J. K., Morens, D. M. The pathology of influenza virus infections. Annu. Rev. Pathol. 3, 499-522 (2008).
- Dobbs, L. G. Isolation and culture of alveolar type II cells. Am. J. Physiol. 258, L134-L147 (1990).
- Corti, M., Brody, A. R., Harrison, J. H. Isolation and primary culture of murine alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 14, 309-315 (1996).
- Beers, M. F., Kim, C. Y., Dodia, C., Fisher, A. B. Localization, synthesis, and processing of surfactant protein SP-C in rat lung analyzed by epitope-specific antipeptide antibodies. J. Biol. Chem. 269, 20318-20328 (1994).
- Phelps, D. S., Floros, J. Localization of pulmonary surfactant proteins using immunohistochemistry and tissue in situ hybridization. Exp. Lung Res. 17, 985-995 (1991).
- Wang, J., et al. Differentiated human alveolar type II cells secrete antiviral IL-29 (IFN-lambda 1) in response to influenza A infection. J. Immunol. 182, 1296-1304 (2009).
- Wang, J., et al. Innate immune response to influenza A virus in differentiated human alveolar type II cells. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 582-591 (2011).
