Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em> Drosophila</em> Netvliezen
Summary
De<em> Drosophila</em> Retina is een kristalachtige rooster uit een klein aantal celtypen die worden gegenereerd in een stereotiepe wijze<sup> 1</sup>. De ontvankelijkheid voor geavanceerde genetische analyse maakt het mogelijk de studie van complexe ontwikkelingsprogramma's. Dit protocol beschrijft dissecties en immunohistochemie van het netvlies in drie afzonderlijke ontwikkelingsstadia, met een focus op fotoreceptor differentiatie.
Abstract
De verbinding oog van Drosophila melanogaster bestaat uit ongeveer 750 ommatidia (unit ogen). Elke ommatidium bestaat uit ongeveer 20 cellen, waaronder lens-afscheidende cellen cone, pigment cellen, een cel borstelharen en acht fotoreceptoren (PRs) R1-R8 2. De PR's hebben zich gespecialiseerd microvillar structuren, de rhabdomeres, die lichtgevoelige pigmenten, de Rhodopsins (RHS) bevatten. De rhabdomeres van zes PR's (R1-R6) vormen een trapezium en bevatten RH1 3 4. De rhabdomeres van R7 en R8 zijn gepositioneerd in tandem in het midden van het trapezium en dezelfde lichtweg. R7 en R8 PR's stochastisch uiten verschillende combinaties van Rhs in twee subtypen 5: In subtype van de 'p', Th3 in p R7s gaat gepaard met RH5 in p R8s, terwijl in subtype van de 'y', RH4 in y R7s wordt geassocieerd met Th6 in R8s y 6 7 8.
Vroege specificatie van PR en ontwikkeling van ommatidia begint in het larvale oog antennelid imaginaire disc, een monolaag van epitheelcellen. Een golf van differentiatie veegt over de schijf 9 en initieert de assemblage van ongedifferentieerde cellen in ommatidia 10-11. De 'oprichter cel' R8 wordt eerst opgegeven en werft R1-6 en vervolgens R7 12-14. Vervolgens, tijdens pupal ontwikkeling, PR differentiatie leidt tot uitgebreide morfologische veranderingen 15, inclusief rhabdomere vorming, synaptogenese en uiteindelijk rh expressie.
In dit protocol wordt beschreven werkwijzen voor retinale secties en immunohistochemie op drie bepaalde perioden retina ontwikkeling die kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen over retinale vorming en ontwikkelingstrajecten pakken. Hier gebruiken we de volgende methoden om de stapsgewijze PR differentiatie te visualiseren op de single-cell niveau in hele berg larvale, midpupal en volwassen netvlies ( <sTrong> Figuur 1).
Protocol
Discussion
1. Problemen oplossen
In onze ervaring, dissecties oefening nodig (tot enkele weken) en worden gefaciliteerd door het bereiken van een comfortabele houding van de handen 21 door te rusten van de ellebogen en onderarmen op de tafel en met de vingers contact maken met de dissectie schotel. Op die manier, alleen de duimen, wijs-en middelvinger uit te voeren subtiele bewegingen.
Verwijderen van de lamina zonder de fotoreceptoren is waarschijnlijk de meest uit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een Ehrman gemeenschap te HY. H., een Jane Coffin Childs Memorial Fund voor Medisch Onderzoek postdoctoraal fellowship aan RJJ, NIH Grant F32EY016309 naar DV, een New York University Dean's Proefschrift Fellowship om DJ, NIH GrantR01 EY13010 op CD en een DFG fellowship aan JR (RI 2208/1- 1). Wij danken Nina Vogt en Pamela Boodram voor commentaar op het manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
- O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
- Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
- Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
- Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
- Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
- Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
- Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
- Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
- Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
- Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
- Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
- Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
- Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
- Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
- Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
- Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
- Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
- Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
- Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).
