Summary

Dissectie en Immunohistochemie van larven, popstadium en Volwassen<em> Drosophila</em> Netvliezen

Published: November 14, 2012
doi:

Summary

De<em> Drosophila</em> Retina is een kristalachtige rooster uit een klein aantal celtypen die worden gegenereerd in een stereotiepe wijze<sup> 1</sup>. De ontvankelijkheid voor geavanceerde genetische analyse maakt het mogelijk de studie van complexe ontwikkelingsprogramma's. Dit protocol beschrijft dissecties en immunohistochemie van het netvlies in drie afzonderlijke ontwikkelingsstadia, met een focus op fotoreceptor differentiatie.

Abstract

De verbinding oog van Drosophila melanogaster bestaat uit ongeveer 750 ommatidia (unit ogen). Elke ommatidium bestaat uit ongeveer 20 cellen, waaronder lens-afscheidende cellen cone, pigment cellen, een cel borstelharen en acht fotoreceptoren (PRs) R1-R8 2. De PR's hebben zich gespecialiseerd microvillar structuren, de rhabdomeres, die lichtgevoelige pigmenten, de Rhodopsins (RHS) bevatten. De rhabdomeres van zes PR's (R1-R6) vormen een trapezium en bevatten RH1 3 4. De rhabdomeres van R7 en R8 zijn gepositioneerd in tandem in het midden van het trapezium en dezelfde lichtweg. R7 en R8 PR's stochastisch uiten verschillende combinaties van Rhs in twee subtypen 5: In subtype van de 'p', Th3 in p R7s gaat gepaard met RH5 in p R8s, terwijl in subtype van de 'y', RH4 in y R7s wordt geassocieerd met Th6 in R8s y 6 7 8.

Vroege specificatie van PR en ontwikkeling van ommatidia begint in het larvale oog antennelid imaginaire disc, een monolaag van epitheelcellen. Een golf van differentiatie veegt over de schijf 9 en initieert de assemblage van ongedifferentieerde cellen in ommatidia 10-11. De 'oprichter cel' R8 wordt eerst opgegeven en werft R1-6 en vervolgens R7 12-14. Vervolgens, tijdens pupal ontwikkeling, PR differentiatie leidt tot uitgebreide morfologische veranderingen 15, inclusief rhabdomere vorming, synaptogenese en uiteindelijk rh expressie.

In dit protocol wordt beschreven werkwijzen voor retinale secties en immunohistochemie op drie bepaalde perioden retina ontwikkeling die kan worden toegepast op een verscheidenheid van vragen over retinale vorming en ontwikkelingstrajecten pakken. Hier gebruiken we de volgende methoden om de stapsgewijze PR differentiatie te visualiseren op de single-cell niveau in hele berg larvale, midpupal en volwassen netvlies ( <sTrong> Figuur 1).

Protocol

1. Introductie In deze video, beschrijven we methoden voor het netvlies dissecties en immunohistochemie op drie gedefinieerde ontwikkeling periodes: de derde instar larven, de midpupal en het volwassen stadium. Hoewel ons protocol werkt ook voor andere popstadium fasen (voor details over eerdere stadia, zie 16), hebben we gekozen voor de midpupal podium, want het is optimaal voor beeldvorming alle PR's in een brandvlak en hun kernen zijn gemakkelijk te identificeren, die vergema…

Discussion

1. Problemen oplossen

In onze ervaring, dissecties oefening nodig (tot enkele weken) en worden gefaciliteerd door het bereiken van een comfortabele houding van de handen 21 door te rusten van de ellebogen en onderarmen op de tafel en met de vingers contact maken met de dissectie schotel. Op die manier, alleen de duimen, wijs-en middelvinger uit te voeren subtiele bewegingen.

Verwijderen van de lamina zonder de fotoreceptoren is waarschijnlijk de meest uit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een Ehrman gemeenschap te HY. H., een Jane Coffin Childs Memorial Fund voor Medisch Onderzoek postdoctoraal fellowship aan RJJ, NIH Grant F32EY016309 naar DV, een New York University Dean's Proefschrift Fellowship om DJ, NIH GrantR01 EY13010 op CD en een DFG fellowship aan JR (RI 2208/1- 1). Wij danken Nina Vogt en Pamela Boodram voor commentaar op het manuscript.

Materials

Reagent
Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) Sigma Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections.
Triton-X 100 Sigma 9002-93-1 Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature.
37% formaldehyde solution Fisher Scientific F75P1GAL Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice.
5% normal horse serum Jackson Immuno Research 008-000-001 Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees.
Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) Invitrogen Molecular Probes A11015
A31572
A31571
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees.
Alexa Fluor 488 Phalloidin A12379 Dilute 1:100 in secondary antibody solution.
Slowfade Gold Antifade reagent Invitrogen Molecular Probes S36936 Mounting medium. Store at -20 degrees.
Glycerol Fisher Scientific G31-1 For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp.
CO2 For anesthetizing adult flies.
Equipment
Two sharp forceps (Dumont #55) Fine Science Tools 11255-20
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture.
Three-well glass dissection dishes Fisher Scientific 21-379
Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) Fine Science tools 26002-10 Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook.
Microscope cover slips (22×22-1 and 24×40-1) Fisher Scientific 12-542A
Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) Fisher Scientific 12-550-143
1.5 ml microcentrifuge tubes
Clear nail polish or Scotch tape
Orbital shaker Bellco
Slide holder box Fisher Scientific
Parafilm Bemis PM996
Thin paintbrush
P20 and P200 micropipettes and tips
Dissecting microscope
Small bucket with ice For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions.

References

  1. Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
  2. Hardie, R. C., D, O. t. t. o. s. o. n. Functional organization of the fly retina. Sensory Physiology. 5, 1-79 (1985).
  3. O’Tousa, J. E. The Drosophila ninaE gene encodes an opsin. Cell. 40, 839-850 (1985).
  4. Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster. Cell. 40, 851-858 (1985).
  5. Rister, J., Desplan, C. The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates. Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).
  6. Chou, W. H. Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells. Neuron. 17, 1101-1115 (1996).
  7. Chou, W. H. Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification. Development. 126, 607-616 (1999).
  8. Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells. Development. 124, 1665-1673 (1997).
  9. Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
  10. Roignant, J. Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).
  11. Tsachaki, M., Sprecher, S. G. Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye. Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).
  12. Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).
  13. Zipursky, S. L. Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough. Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).
  14. Basler, K., Hafen, E. Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila. Bioessays. 13, 621-631 (1991).
  15. Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia. Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).
  16. Walther, R. F., Pichaud, F. Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system. Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).
  17. Wolff, T., Sullivan, W. e. a. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. Drosophila Protocols. , (2000).
  18. Wolff, T. Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes. CSH Protoc. 2007, pdb prot4715 (2007).
  19. Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).
  20. Morante, J., Desplan, C. Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development. Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).
  21. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging. J. Vis. Exp. (37), e1936 (2010).
  22. Stowers, R. S., Schwarz, T. L. A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype. Genetics. 152, 1631-1639 (1999).
  23. Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics. Development. 127, 851-860 (2000).
  24. Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina. PLoS Comput. Biol. 8, e1002357 (2012).
  25. Johnston, R. J. Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye. Cell. 145, 956-968 (2011).
  26. Jukam, D., Desplan, C. Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate. Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).
  27. Vasiliauskas, D. Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors. Nature. 479, 108-112 (2011).
  28. Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).

Play Video

Cite This Article
Hsiao, H., Johnston Jr., R. J., Jukam, D., Vasiliauskas, D., Desplan, C., Rister, J. Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas. J. Vis. Exp. (69), e4347, doi:10.3791/4347 (2012).

View Video