ゼブラフィッシュ胚骨格筋のレーザー招いた傷害
Summary
ここで紹介する方法は、高エネルギーのレーザーパルスと時間でこれらの損傷とその回復のその後の分析でライブゼブラフィッシュ胚の正確な傷害を含む。我々はまた、遺伝的に単一標識又は骨格筋細胞のグループが中に、レーザー光誘起損傷後に追跡することができる方法を示しています。
Abstract
様々な実験的アプローチがmyotoxin注射（ブピバカイン、心臓毒性またはnotexin）、筋移植（除神経·脈管切除再生を誘導した）、激しい運動ではなく、ネズミ筋ジストロフィーのモデルを含む、筋肉の再生を研究することを目的として筋損傷を誘発するためにマウスに使用されてきたmdxマウス（これらの方法の見直しのための1を参照）など。ゼブラフィッシュでは、遺伝学的ア プローチは、筋ジストロフィーの表現型（例えばrunzel 2またはsapje 3など）を展示し、筋ジストロフィーに関連する遺伝子の発現をブロック4オリゴヌクレオチド、アンチセンスモルフォ変異株が挙げられる。加えて、化学的ア プローチは、それによって最終的に筋ジストロフィー5につながるhypercontraction、その結果、また、ガランタミン、化学阻害する化合物とアセチルコリンエステラーゼなどが可能です。しかし、遺伝的および薬理学的アプローチグラム物理的に与えた傷害の程度がより簡単に空間的にも時間的に制御されているのに対し、1 enerally、個々の内のすべての筋肉に影響を与えます。ローカライズされた物理的な損傷は、内部統制として、反対の筋肉の評価を可能にする。別のグループは最近、非常に局所的に個々の胚ゼブラフィッシュの筋肉の細胞膜にダメージを与える二光子レーザー（822 nm）での使用を報告しながら、実際、我々は最近、ゼブラフィッシュ胚6に骨格筋の再生を研究するためにレーザーを介する細胞アブレーションを使用細胞7。
ここでは、ゼブラフィッシュ胚における骨格筋細胞傷害に対してmicropointレーザー（アンドールテクノロジー）を使用する方法について検討する。 micropointレーザーは435 nmの波長での標的細胞の切除に適している高エネルギーのレーザーです。レーザー顕微鏡を同時にfで使用できるような方法で顕微鏡（我々のセットアップで、ツァイスの光学顕微鏡）に接続されているまたは試料上および創傷（明視野、蛍光）の効果を可視化するためのレーザー光を当てた。レーザーパルスを制御するためのパラメータは、波長、強度、パルス数を含む。
その透明性と外部の胚発生に起因して、ゼブラフィッシュ胚では、レーザ誘起損傷の両方のためとその後の回復を研究するために非常に適しています。 1〜2日後の受精、体節、骨格筋細胞が徐々にテール8,9にトランクから体節形成の進行による後方から前方に成熟する。これらの段階で、胚は、自発的にけいれんや水泳を開始します。ゼブラフィッシュは、最近、組織再生の研究のための重要な脊椎動物のモデル生物として認識されている、組織のように多くの種類（心臓、神経、血管など）が成人ゼブラフィッシュ10、11の損傷後に再生することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
レーザー媒介傷害はゼブラフィッシュ胚で制御された条件の下で再生を勉強するために、細胞を切除することにより、所望の大きさの傷を負わせるための強力な方法です。特に、細胞を正確に標的とすることができる（ 図2）と傷害エリアとタイミングの両方を制御することができる。その後、損傷部位と再生のプロセスが容易に、監視記録された（ 図3）と（ <strong…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、技術的なヘルプやアドバイスを貰えるボブ（アンドールテクノロジー）に感謝。 SA-S。ドイツ学術振興協会（DFG）のハイゼンベルク交わりによってサポートされています。この作品は、助成SE2016/7-1をDFGによってサポートされていました。
Materials
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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