الفيروسية النانوية ل<em> في الجسم الحي</em> التصوير ورم
Summary
النانوية النبات الفيروسية (VNPs) واعدة منصات لتقديم الطلبات في الطب الحيوي. هنا، نحن تصف الإجراءات لإكثار النبات VNP، وتنقية وتوصيف، وbioconjugation. وأخيرا، وتبين لنا تطبيق VNPs لصاروخ موجه الورم والتصوير باستخدام نموذج طعم أجنبي الماوس والتصوير مضان.
Abstract
استخدام المواد النانوية لديه القدرة على إحداث ثورة في مواد العلوم والطب. ويجري حاليا التحقيق في عدد من الجسيمات النانوية لتطبيقات مختلفة في مجال التصوير والعلاج. ويمكن اعتبار النانوية الفيروسية (VNPs) المشتقة من النباتات عن النفس تجميعها bionanomaterials مع أحجام محددة والأشكال. الفيروسات النباتية قيد التحقيق في المختبر شتاينميتز تشمل الجسيمات متعدد السطوح التي شكلتها فيروس تبرقش اللوبيا (CPMV) وفيروس تبرقش بروم (BMV)، وكلاهما 30 نانومتر في القطر. نحن نعمل على تطوير الهياكل أيضا على شكل قضيب والخيطية المستمدة من الفيروسات النباتية التالية: فيروس موزاييك التبغ (TMV)، والتي تشكل قضبان جامدة مع أبعاد 300 نانومتر بنسبة 18 نانومتر، والبطاطا X فيروس (PVX)، والتي تشكل الجزيئات الخيطية 515 نانومتر في الطول و 13 نانومتر في العرض (ويشار إلى القارئ الحكام. 1 و 2 لمزيد من المعلومات عن VNPs).
<p class="jove_content"> من وجهة عالم المواد وجهة نظر، VNPs هي اللبنات جذابة لأسباب عدة: الجزيئات monodisperse، يمكن أن تنتج بسهولة على نطاق واسع في بلانتا، مستقرة للغاية، وحيويا. أيضا، VNPs هي "برمجة" وحدات، والتي صممت خصيصا يمكن استخدام أساليب التعديل الوراثي أو bioconjugation الكيميائية 3. ومن المعروف أن هيكل VNPs بالقرار الذرية، ويمكن أن يتم من تعديلات بدقة المكانية على المستوى الذري 4، مستوى من التحكم الذي لا يمكن أن يتحقق باستخدام المواد النانوية الاصطناعية مع تقنيات للدولة من بين الفن الحالي.في هذه الورقة، ونحن تصف نشر CPMV، PVX، TMV، وBMV في ungiuculata فيجنا النباتات ونيكوتيانا benthamiana. وترد استخراج وتنقية بروتوكولات لكل VNP. يتم وصف طرق لتوصيف وتنقية VNPs كيميائيا المسمى. في هذه الدراسة، ونحن نركز على الفصلemical وسم VNPs مع fluorophores (مثل اليكسا فلور 647) والبولي ايثيلين جلايكول (PEG). الأصباغ تسهيل تتبع والكشف عن VNPs 5-10، ويقلل PEG المناعية البروتينية من الجسيمات النانوية مع تعزيز الدوائية من 8،11. علينا أن نبرهن الورم صاروخ موجه مضاد للفيروسات من VNPs باستخدام طعم أجنبي ورم نموذج الفأر. يتم استخدام مزيج من التصوير مضان من الأنسجة خارج الجسم باستخدام نظام تصوير مايسترو، الكمي مضان في الأنسجة المتجانس، والفحص المجهري متحد البؤر لدراسة biodistribution. يتم مسح VNPs عبر نظام شبكي بطاني (RES)؛ يتحقق الورم صاروخ موجه بشكل سلبي من خلال تعزيز النفاذية والاستبقاء (EPR) أثر 12. تكنولوجيا النانو هي قوية VNP المكونات وتلعب التكنولوجيا لصورة وعلاج المرض المواقع في الجسم الحي. نحن نعمل على تطوير المزيد من الشحنات للقيام VNPs المخدرات والأنصاف التصوير سريريا ذات الصلة، وكذلك بروابط الأنسجة محددة لاستهداف المستقبلات الجزيئية overexpressed في السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول نهج للالتعديل الكيميائي للVNPs وتطبيقاتها في مجال التصوير للورم الجسم الحي. تقنيات التصوير مضان الحيوان، الكمي مضان، والمناعية المقدمة هنا هي مفيدة لدراسة وتقييم الورم biodistribution صاروخ موجه. هذه التقنيات توفر معلومات قيمة فيما يتعلق بالوص…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIBIB EB009105 R00 المنح (لNFS) وEB011317 P30 (لNFS)، والمعاهد الوطنية للصحة / NIBIB التدريب منحة T32 EB007509 (لAMW)، وجامعة كيس وسترن ريزيرف للاستثمار التحالف التخصصات المنحة (لNFS)، وحالة المركز الشامل للسرطان P30 CA043703 منحة (لNFS). نشكر مختبر الباحثين شتاينميتز الطالب الجامعي لأيديهم على الدعم: نادية آيت، كيفن تشن، سوراف (SID) داي، أليس يانغ، ألكسندر سام، كريغ كروز D'، ستيفن هيرن، راندولف لورين، بريان لذلك، وبول Chariou .
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 |
References
- Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
- Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
- Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
- Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
- Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
- Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
- Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
- Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
- Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
- Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
- Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
- Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
- Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
- Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with “click” chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
- Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
- Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
- Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).
