Viral Nanopartikel für<em> In vivo</em> Tumor Imaging
Summary
Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.
Abstract
Die Verwendung von Nanomaterialien hat das Potenzial, Materialwissenschaft und Medizin zu revolutionieren. Derzeit sind eine Anzahl verschiedener Nanopartikel ist für Anwendungen in der Bildgebung und Therapie untersucht. Viral-Nanopartikel (VNPS) aus Pflanzen gewonnen werden kann als self-assembled Bionanomaterialien mit definierten Größen und Formen betrachtet werden. Pflanzenviren untersuchten im Labor gehören Steinmetz ikosaedrischen Teilchen durch Kuherbsen-Mosaikvirus (CPMV) und Brome Mosaik Virus (BMV), die beide 30 nm im Durchmesser sind, gebildet. Wir entwickeln auch stabförmigen und filamentöse Strukturen aus den folgenden Pflanzenviren abgeleitet: Tabak-Mosaik-Virus (TMV), die starre Stäbe bildet mit den Abmessungen von 300 nm von 18 nm und Potato virus X (PVX), die filamentöse Partikel 515 bilden nm Länge und 13 nm in der Breite (der Leser auf refs bezeichnet. 1 und 2 für weitere Informationen über VNPS).
<p class="jove_content"> Von A Materialwissenschaftler Sicht sind VNPS attraktive Bausteine aus mehreren Gründen: Die Partikel sind monodisperse, kann mit Leichtigkeit in großem Maßstab in planta hergestellt werden, sind außergewöhnlich stabil und biokompatibel. Auch sind VNPS "programmierbar"-Einheiten, die speziell entwickelt werden mit gentechnischen Veränderung oder chemische Biokonjugation Methoden 3 können. Die Struktur der VNPS wird bis zu atomarer Auflösung bekannt und Modifikationen können mit räumlicher Präzision durchgeführt werden auf atomarer Ebene 4, ein Maß an Kontrolle, die nicht erreicht werden kann mit synthetischen Nanomaterialien mit aktuellen State-of-the-art Technologien werden.In diesem Papier beschreiben wir die Ausbreitung von CPMV, PVX, TMV und BMV in Vigna ungiuculata und Nicotiana benthamiana Pflanzen. Extraktion und Reinigung Protokolle für jede VNP gegeben. Methoden zur Charakterisierung von gereinigtem und chemisch-markierten VNPS beschrieben. In dieser Studie haben wir am ch konzentrierenemical Kennzeichnung VNPS mit Fluorophoren (zB Alexa Fluor 647) und Polyethylenglykol (PEG). Die Farbstoffe erleichtern Verfolgung und Erfassung der VNPS 5-10, und PEG reduziert Immunogenität der proteinartigen Nanopartikel gleichzeitig ihre Pharmakokinetik 8,11. Wir zeigen Tumor Homing von PEGylierten VNPS mit der Maus Xenograft-Tumor-Modell. Eine Kombination von Fluoreszenz-Bildgebung von Gewebe ex vivo mit Maestro Imaging System, Fluoreszenz Quantifizierung in homogenisierten Geweben und konfokale Mikroskopie wird verwendet, um Bioverteilung studieren. VNPS werden über das retikuloendotheliale System (RES) gelöscht ist; Tumor einfindende wird passiv über das erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Wirkung 12 gelöst. Der VNP Nanotechnologie ist ein leistungsstarkes Plug-and-play-Technologie auf Bild und Behandlung von Seiten der Erkrankung in vivo. Wir arbeiten weiter an VNPS um Drogen Frachten und klinisch relevante Bildgebung Einheiten sowie Gewebe-spezifische Liganden zu tragenZiel molekularen Rezeptoren bei Krebs und kardiovaskuläre Erkrankungen überexprimiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt einen Ansatz für die chemische Modifikation von VNPS und deren Anwendungen zur in vivo-Tumordarstellung. Die Tier-Fluoreszenz-Imaging-, Fluoreszenz-Quantifizierung und Immunhistochemie hier vorgestellten Verfahren sind nützlich für das Studium Bioverteilung und Auswertung Tumor Homing. Diese Techniken wertvolle Informationen über den Zugang der Nanopartikel an den Tumor durch die EPR-Effekt. Durch die Kombination der Ergebnisse aus den verschiedenen analytischen Methoden, erhalten wi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH / NIBIB Zuschüsse R00 EB009105 (NFS) und P30 EB011317 (NFS), ein NIH / NIBIB Ausbildungsförderung T32 EB007509 (um AMW), einem der Case Western Reserve University Interdisziplinäre Alliance Investment Grant (NFS) unterstützt, und ein Gehäuse Comprehensive Cancer Center Gewährung P30 CA043703 (NFS). Wir danken den Steinmetz Lab Bachelor-Student Forscher für ihre tatkräftige Unterstützung: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian So, und Paul Chariou .
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| VNP production | |||
| Indoor plant chamber | Percival Scientific | E-41L2 | |
| V. unguiculata seeds (California black-eye no. 5) | Burpee | 51771A | |
| N. benthamiana seeds | N. benthamiana seeds were a gift from Salk Institute. Seeds are produced through plant propagation. | ||
| Carborundum | Fisher | C192-500 | |
| Pro-mix BX potting soil | Premier Horticulture | 713400 | |
| Jack’s Professional 20-10-20 Peat-Lite Fertilizer | JR Peters | 77860 | |
| Equipment | |||
| 50.2 Ti rotor | Beckman | 337901 | |
| SW 32 Ti rotor | Beckman | 369694 | |
| Optima L-90K ultracentrifuge | Beckman | 365672 | |
| SLA-3000 rotor | Thermo Scientific | 07149 | |
| SS-34 rotor | Thermo Scientific | 28020 | |
| Sorvall RC-6 Plus centrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Polypropylene bottle | Beckman | 355607 | For SLA-3000 rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 357002 | For SS-34 rotor |
| Ultra-Clear tube | Beckman | 344058 | For sucrose gradient and SW 32 Ti rotor |
| Polycarbonate bottle | Beckman | 355618 | For pelleting and 50.2 Ti rotor |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop2000c | |
| PowerEase 500 pre-cast gel system | Invitrogen | EI8675EU | |
| Superose 6 10/300 GL (24 ml) size-exclusion column | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| ÄKTA Explorer 100 Chromatograph | GE Healthcare | 28-4062-66 | |
| Allegra X-12R | Beckman | 392302 | Benchtop centrifuge |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Maestro 2 | Caliper Life Sciences | In vivo imaging system | |
| Tissue-Tearor | Biospec Products | 985370-395 | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite-200 | |
| Transmission electron microscope | ZEISS | Libra 200FE | |
| FluoView laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| Chemicals and Reagents | |||
| 3-ethynylaniline | Sigma Aldrich | 498289-5G | |
| 384 well black plate | BD Biosciences | 353285 | |
| 4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS gel | Invitrogen | NP0321BOX | |
| 4X LDS sample buffer | Invitrogen | NP0008 | |
| Acetic Acid | Fisher | A385-500 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 271004-1L | |
| Alexa Fluor 647 azide | Invitrogen | A10277 | |
| Alexa Fluor 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A20006 | |
| Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters | Millipore | UFC501096 | 10 kDa cut-off |
| Aminoguanidine hydrochloride | Acros Organics | 36891-0250 | |
| Boric acid | Fisher | A74-500 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Fisher | BP101-25 | |
| CsCl | Acros Organics | 42285-1000 | |
| DAPI | MP Biomedicals | 157574 | |
| Dimethyl sulfoxide | Fisher | BP231-100 | |
| Filter paper | Fisher | 09-801K | P5 grade |
| FITC anti-mouse CD31 | BioLegend | 102406 | |
| Goat serum | Invitrogen | 16210-064 | |
| KCl | Fisher | BP366-500 | |
| L-ascorbic acid sodium salt | Acros Organics | 35268-0050 | |
| Methanol | Fisher | A412P-4 | |
| MgCl2 | Fisher | BP214-500 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-544-3 | |
| Microscope cover glass | VWR | 48366-277 | |
| MOPS buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| mPEG-mal | Nanocs | PG1-ML-2k | MW 2000 |
| mPEG-N3 | Nanocs | PG1-AZ-5k | MW 5000 |
| mPEG-NHS | Nanocs | PG1-SC-5k | MW 5000 |
| NaCl | Fisher | BP358-212 | |
| Oregon Green 488 succinimidyl ester *6-isomer* | Invitrogen | O-6149 | |
| p-toluenesulfonic acid monohydrate | Acros Organics | 13902-0050 | |
| Permount | Fisher | SP15-100 | |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | BP362-1 | |
| Sodium acetate | Fisher | BP333-500 | |
| Sodium nitrite | Acros Organics | 42435-0050 | |
| Sodium sulfite | Amresco | 0628-500G | |
| Sucrose | Fisher | S6-500 | |
| TEM grid | Ted Pella | FCF-400Cu | |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | TX1568-1 | |
| β-mercaptoethanol | Fisher | O3446I-100 | |
| Tissue Culture | |||
| Fetal bovine serum | Invitrogen | 12483-020 | |
| Hemocytometer | Fisher | 0267110 | |
| HT-29 cells | ATCC | HTB-38 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-080 | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 10378-016 | |
| RPMI-1640 | Invitrogen | 31800-089 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 431080 | 175 cm2 |
| Trypan Blue | Thermo Scientific | SV30084.01 | |
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300-054 | |
| Animal Studies | |||
| 18% Protein Rodent Diet | Harlan Teklad | Teklad Global 2018S | Alfalfa free diet |
| Insulin syringe | BD Biosciences | 329410 | 28 gauge |
| Isoflurane | Baxter | AHN3637 | |
| Matrigel Matrix basement membrane | BD Biosciences | 356234 | |
| NCR nu/nu mice | CWRU School of Medicine Athymic Animal and Xenograft Core Facility |
||
| Sterile syringe | BD Biosciences | 305196 | 18 1/2 gauge |
| Tissue-Tek CRYO-OCT Compound | Andwin Scientific | 4583 |
References
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