结合荧光染色体复制时序<em在原位</em>杂交
Summary
染色体复制定时分析的定量方法进行说明。的方法，利用结合BrdU掺入荧光<em在原位</em>，杂交（FISH），以评估哺乳动物染色体的复制定时。这种技术允许在同一细胞重新排列和未重排的染色体直接比较。
Abstract
哺乳动物DNA复制的启动在染色体上的多个站点在不同的时间在S期，随着时间的复制程序。被认为是一个动态的过程受反应的表观遗传修饰的组织特异性和发展线索，规范的复制时间。但是，调节，当启动染色体上DNA复制的机制仍然知之甚少。同源染色体的复制同步，但有显着的例外情况。例如，在雌性哺乳动物细胞中的两个X染色体中的一个成为后期复制经历一个过程被称为X染色体失活1。除了这种延迟复制时间，估计要2-3小时，一个X染色体上，成为大多数基因转录沉默。此外，一个离散的顺式作用位点，被称为X染色体失活中心，调节此X染色体失活过程中，包括第Ë感应对整个失活的X染色体的复制时间延迟。此外，一些在肿瘤细胞和细胞中的染色体重排暴露于电离辐射，显示复制时间> 3小时，影响了整个染色体2,3显着延迟。我们的实验室最近的工作表明，中断的离散顺式作用常染色体位点在极晚，影响了整个第4号染色体的复制型。额外的染色体工程的研究表明，某些染色体重排，影响了许多不同的染色体造成这种不正常的复制计时表型，这表明所有的哺乳动物染色体包含离散的顺式作用位点，控制适当的个体染色体的复制时间。
在这里，我们提出了一个方法的定量分析结合荧光原位杂交染色体复制时间。这方法允许在同一细胞同源染色体之间的复制时间的直接比较，并被改编6。此外，这种方法可以明确识别的染色体重排，与影响整个染色体的复制时间变化的。这种方法有优势，最近开发的高通量微阵列或不能区分同源基因上的重新排列和重排染色体的测序协议。此外，因为这里描述的方法的计算结果单细胞，它可以检测染色体重排，在一个群体中只有一小部分的细胞中存在的染色体复制定时变化。
Protocol
Representative Results
Discussion
染色体利差的准备是成功的复制时序分析的关键步骤这里描述。列入的秋水仙胺预处理步骤之前，低渗处理可能有助于在频率和扩频的有丝分裂细胞。我们通常会公开细胞，以colcemdi的1-3小时收获前，和使用秋水仙碱，终浓度为10微克/毫升。然而，列入秋水仙碱预处理步骤可能会改变G2的长度，因此可能会改变明显凝结染色体的复制时间和状态。
此过程可以应用?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的，CA131967美国国家癌症研究所的资助。
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
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IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
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