Chromosoom repliceren Timing In combinatie met TL-<em> In situ</em> Hybridisatie

Summary

Een kwantitatieve methode voor de analyse van chromosoom replicatie timing beschreven. De werkwijze gebruikt BrdU opname in combinatie met fluorescent<em> In situ</em> Hybridisatie (FISH) de replicatie timing van zoogdier chromosomen beoordelen. Deze techniek maakt de directe vergelijking van herschikte en niet-herschikte chromosomen binnen dezelfde cel.

Abstract

Zoogdier DNA replicatie start op meerdere plaatsen langs chromosomen op verschillende momenten in S fase na een tijdelijke replicatieprogramma. De specificatie van replicatie timing wordt beschouwd als een dynamisch proces gereguleerd door weefsel-specifieke en ontwikkelingsstoornissen signalen die inspelen op epigenetische modificaties zijn. Echter, de mechanismen tot regeling van waar en wanneer de replicatie van DNA initieert samen chromosomen blijft slecht begrepen. Homologe chromosomen meestal synchroon te repliceren, maar er zijn uitzonderingen op deze regel. Bijvoorbeeld, in vrouwelijke zoogdiercellen een van de twee X-chromosomen wordt late replicerende door een proces dat X inactivatie ^1. Samen met deze vertraging in de replicatie timing, geschat op 2-3 uur te zijn, raken de meerderheid van de genen transcriptioneel zwijgen over een X-chromosoom. Bovendien een discrete cis-acting locus, bekend als de X inactivatie centrum regelt deze X inactivatie, inclusief the inductie van vertraagde replicatie timing op de gehele inactieve X-chromosoom. Bovendien zijn bepaalde chromosoomherschikkingen in kankercellen en cellen blootgesteld aan ioniserende straling tonen een aanzienlijke vertraging van replicatie timing> 3 uren beïnvloedt het hele chromosoom ^2,3. Recent werk van ons lab geeft aan dat verstoring van discrete cis-werkende autosomale loci resulteren in een zeer laat repliceren fenotype dat het hele chromosoom ⁴ beïnvloedt. Extra 'chromosoom engineering' studies geven aan dat bepaalde chromosoom herschikkingen van invloed zijn veel verschillende chromosomen resultaat in deze abnormale replicatie-timing fenotype, wat suggereert dat alle zoogdieren chromosomen discrete cis-werkende loci dat een goede replicatie timing van de individuele chromosomen ⁵ besturen bevatten.

Hier geven we een werkwijze voor de kwantitatieve analyse van chromosoom replicatie timing gecombineerd met fluorescente in situ hybridisatie. Dezewerkwijze maakt een rechtstreekse vergelijking van replicatie timing tussen homologe chromosomen binnen dezelfde cel, en is aangepast van ^6. Bovendien maakt deze werkwijze de eenduidige identificatie van chromosomale herschikkingen die correleren met veranderingen in replicatie timing dat het gehele chromosoom beïnvloeden. Deze methode heeft voordelen ten opzichte van recent ontwikkelde high throughput micro-array of sequencing protocollen die geen onderscheid kunnen maken tussen homologe allelen aanwezig zijn op herschikt en niet-herschikt chromosomen. Bovendien, omdat de hier beschreven methode resulteert afzonderlijke cellen kan detecteren veranderingen in chromosoom replicatie timing chromosomale herschikkingen die aanwezig zijn in slechts een fractie van de cellen in een populatie.

Protocol

1. BrdU Oprichting (Terminal Labeling) Cellaag tot ongeveer 70% confluentie in een 150 mm weefselkweekplaat 24 uur vóór de toevoeging van BrdU. Vervangen media met vers compleet medium met 20 ug / ml BrdU (Sigma) op geschikte tijdstippen voor de oogst. De tijdsduur cellen worden gekweekt in media met BrdU zal variëren met cel soort, meestal de G2 fase duurt 2 tot 5 uur (Figuur 1). 2. Chromosoom Oogst van Monolayer Cellen Culturen Verw…

Representative Results

Een voorbeeld van de replicatie timing analyse van humaan chromosoom 6 is in figuur 2. Cellen die een deletie van het gen ASAR6 4, gelegen op 6q16.1, blootgesteld aan BrdU gedurende 5 uur, geoogst voor mitotische cellen en bewerkt voor FISH met chromosoom 6 verf probe (Vysis) en voor opname BrdU. Merk op dat er een significant verschil in de BrdU bandpatroon tussen de twee 6, die consistent is met een vertraging van replicatie timing van> 2 uur voor een van de chromosoom 6 is [zie 4</…

Discussion

De bereiding van chromosoom spreads is een kritische stap voor de succesvolle replicatie-timing assay beschreven. De opname van een Colcemid voorbehandelingsstap vóór de hypotonische behandeling kan helpen bij de frequentie en verspreiding van mitotische cellen. We meestal bloot cellen colcemdi gedurende 1-3 uur vóór de oogst en gebruik Colcemid in een eindconcentratie van 10 ug / ml. Echter, de opneming van een Colcemid voorbehandelingsstap veranderen de lengte van G2 en kunnen derhalve de schijnbare replicatie tim…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 μg/μl
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varies
LSI/WCP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	MetaSystems Group	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope	Olympus	BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Digital Camera	Olympus	UCMAD3
			IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES Formamide Solutions 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamide* (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d2H20 pH to 7.0 with HCl (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH2O pH to 7.0 with HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH2O to volume PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): dH2O to volume 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) dH2O to volume. PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) 25 ml PN buffer (Recipe above) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.