Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em> In situ</em> Hybridisierung
Summary
Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit fluoreszierenden<em> In situ</em> Hybridisierung (FISH), um die Replikation des Säuger-Chromosomen Timing zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht den direkten Vergleich von neu geordnet und un-neu Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle.
Abstract
Säuger-DNA-Replikation initiiert an mehreren Stellen entlang Chromosomen zu verschiedenen Zeiten während der S-Phase, nach einer zeitlichen Replikationsprogramm. Die Spezifikation der Replikation Zeitpunkt wird angenommen, dass ein dynamischer Prozess, durch Gewebe-spezifische und Entwicklungsstörungen Cues, die als Reaktion auf epigenetische Modifikationen geregelt werden. Allerdings bleibt die Regulationsmechanismen, wo und wann die DNA-Replikation initiiert zusammen Chromosomen kaum verstanden. Homologen Chromosomen in der Regel synchron replizieren, aber es gibt Ausnahmen von dieser Regel. Zum Beispiel in weiblichen Säugerzellen eines der beiden X-Chromosomen wird späten replizierende durch einen Prozess als X-Inaktivierung 1 bekannt. Zusammen mit dieser Verzögerung bei der Replikation Timing, schätzungsweise 2-3 Stunden sein, werden die Mehrzahl der Gene transkriptionell auf einem X-Chromosom zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus regelt eine diskrete cis-wirkende Locus, als die X-Inaktivierung Zentrum bekannt, diese X-Inaktivierung, einschließlich the Induktion verzögerte Replikation Timing auf dem gesamten inaktiven X-Chromosom. Darüber hinaus können bestimmte Chromosomenveränderungen in Krebszellen und Zellen gefunden Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zeigen eine signifikante Verzögerung bei der Replikation Timing von> 3 Stunden, wirkt sich auf die gesamte Chromosom 2,3. Neuere Arbeiten aus unserem Labor zeigt, dass Störungen von diskreten cis-wirkenden autosomal loci Ergebnis in einem extrem spät replizierende Phänotyp, die das gesamte Chromosom 4 beeinflusst. Weitere 'Chromosom Engineering "Studien zeigen, dass bestimmte Chromosomenumlagerungen die viele verschiedene Chromosomen Ergebnis in diesem abnormen Replikation-Timing Phänotyp, was darauf hindeutet, dass alle Säugetiere Chromosomen diskrete cis-wirkenden Loci, die die Replikation ordnungsgemäß Zeitpunkt der einzelnen Chromosomen 5 zu steuern enthalten.
Hier stellen wir ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chromosomenreplikation Timing mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung kombiniert. DiesVerfahren ermöglicht einen direkten Vergleich der Replikation Timing zwischen homologen Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle, und wurde aus 6 angepasst. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren für die eindeutige Identifizierung von chromosomalen Umordnungen, die mit Veränderungen in der Replikation Timing, das das gesamte Chromosom beeinflusst korrelieren. Diese Methode hat Vorteile gegenüber kürzlich entwickelten Hochdurchsatz-Mikro-Array oder Sequenzierung Protokolle, die nicht zwischen Allele unterscheiden präsentieren auf neu und Chromosomen un-umgeordnet können. Darüber hinaus, weil das hier beschriebene Verfahren wertet Einzelzellen kann Ermittlung von Änderungen in Chromosomenreplikation Timing auf chromosomale Rearrangements, die nur in einer Fraktion der Zellen in einer Population sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Herstellung von Chromosom ausbreitet ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Replikation-Timing-Assay beschrieben. Der Einschluss eines Colcemid Vorbehandlungsschritt vor dem hypotonische Behandlung kann in der Frequenz und Ausbreiten des mitotischen Zellen zu unterstützen. Wir typischerweise freizulegen Zellen für 1-3 h colcemdi vor der Ernte und in einer Endkonzentration von 10 ug / ml Colcemid benutzen. Jedoch kann die Einbeziehung eines Colcemid Vorbehandlungsschritt verändern die Länge der G2 u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Cancer Institute, CA131967 unterstützt.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
| Anti-BrdU-FITC | Roche Millipore | 11202593001 MAB326F | 50 μg/μl |
| Nick Translation Kit | Abbott Molecular (Vysis) | 07J00-0001 | |
| Spectrum Orange dUTP | Abbott Molecular (Vysis) | 02N33-050 | |
| CEP | Abbott Molecular (Vysis) | Varies | |
| LSI/WCP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 06J67-011 | |
| CEP hybridization buffer | Abbott Molecular (Vysis) | 07J36-001 | |
| Chromosome paints | MetaSystems Group | D-14NN-050-TR | |
| Olympus BX61 Fluorescent Microscope | Olympus | BX61TRF-1-5 | |
| Microscope imaging software system | Applied Imaging | Cytovision 3.93.1 | |
| Digital Camera | Olympus | UCMAD3 | |
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IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES 35 ml Formamide* (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins. |
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