Kromosom Replikera Timing kombination med fluorescerande<em> In situ</em> Hybridisering

Summary

En kvantitativ metod för analys av kromosom-replikering timing beskrivs. Metoden utnyttjar BrdU-inkorporering i kombination med fluorescerande<em> In situ</em> Hybridisering (FISH) för att bedöma replikering tidpunkten för däggdjur kromosomer. Denna teknik möjliggör direkt jämförelse av omarrangerade och un-ordnas kromosomer i samma cell.

Abstract

Däggdjurs-DNA-replikation initieras vid flera ställen längs kromosomer vid olika tidpunkter under S-fasen, efter en tidsmässig replikering program. Specifikationen av replikering timing tros vara en dynamisk process regleras av vävnads-specifika och utvecklande ledtrådar som är lyhörda för epigenetiska modifieringar. Dock fortfarande de mekanismer som reglerar var och när DNA-replikation initierar längs kromosomer dåligt kända. Homologa kromosomer replikeras oftast synkront, men det finns viktiga undantag från denna regel. Till exempel i kvinnliga däggdjursceller en av de två X-kromosomer blir sen replikera genom en process som kallas X inaktivering ^1. Tillsammans med denna fördröjning i replikering timing, uppskattas till 2-3 timmar, blir majoriteten av gener transkriptionellt tystas på en X-kromosom. Dessutom reglerar en diskret cis-verkande lokuset, känd som X inaktivering centrum, denna inaktivering X, inbegripet the induktion av fördröjd replikering timing på hela inaktiva X-kromosomen. Dessutom har vissa kromosom omdisponeringar som finns i cancerceller och celler som exponeras för joniserande strålning visa en signifikant fördröjning i replikering tidpunkten för> 3 timmar som påverkar hela kromosom ^2,3. Senaste arbete från vår labb visar att avbrott i diskreta cis-agerande autosomalt loci resulterar i en extremt sent replikera fenotyp som påverkar hela kromosom ^4. Ytterligare "kromosom tekniska" studier visar att vissa kromosom omflyttningar påverkar många olika kromosomer resulterar i denna onormala replikering-timing fenotyp, vilket tyder på att alla däggdjur kromosomer innehåller diskreta cis-verkande loci som styr korrekt replikering tidpunkten för enskilda kromosomer ^5.

Här presenterar vi en metod för kvantitativ analys av kromosom-replikering timing kombinerat med fluorescent in situ hybridisering. Dettametod möjliggör en direkt jämförelse av replikering timing mellan homologa kromosomer inom samma cell, och anpassades från ^6. Dessutom tillåter denna metod för otvetydig identifiering av kromosomala rearrangemang som korrelerar med förändringar i replikering timing som påverkar hela kromosomen. Denna metod har fördelar jämfört med nyutvecklade hög genomströmning mikro-array eller sekvensering protokoll som inte kan skilja mellan homologa alleler som finns på omarrangerade och un-ordnas kromosomer. Dessutom, eftersom den här beskrivna metoden utvärderar enskilda celler, kan man upptäcka förändringar i kromosom-replikering timing på kromosomala rearrangemang som är närvarande i endast en bråkdel av cellerna i en population.

Protocol

1. BrdU Införlivande (Terminal Märkning) Plate celler till cirka 70% konfluens i en 150 mm vävnadsodlingsskål 24 h före tillsatsen av BrdU. Ersätt media med färskt komplett medium innehållande 20 pg / ml BrdU (Sigma) vid lämpliga tidpunkter före skörd. Den tid celler odlas i medium med BrdU varierar med celltyp och art, typiskt G2-fasen varar mellan 2 och 5 timmar (figur 1). 2. Kromosom Skörd av monolager Cells kulturer Avlä…

Representative Results

Ett exempel på replikering timing analys för human kromosom 6 visas i figur 2. Celler som innehåller en deletion av ASAR6 genen 4, som ligger vid 6q16.1, utsattes för BrdU under 5 timmar, skördas för mitotiska celler och bearbetas för fisk med en kromosom 6 färg sond (Vysis) och för BrdU inkorporering. Observera att det finns en signifikant skillnad i BrdU bandmönster mellan de två 6 s, vilket är förenligt med en fördröjning i replikation tidpunkten för> 2 h för en av krom…

Discussion

Beredningen av kromosom sprider är ett kritiskt steg för att framgångsrikt replikering-timing analys som beskrivits här. Införandet av en Colcemid förbehandlingssteg före hypoton behandling kan hjälpa frekvens och spridning av mitotiska celler. Vi utsätter typiskt celler till colcemdi för 1-3 timmar före skörd och användning Colcemid vid en slutlig koncentration av 10 ng / ml. Emellertid kan införande av ett kolcemid förbehandlingssteg ändra längden på G2 och följaktligen kan förändra den skenbara r…

Materials

Name of Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 μg/μl
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Varies
LSI/WCP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP hybridization buffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	MetaSystems Group	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluorescent Microscope	Olympus	BX61TRF-1-5
Microscope imaging software system	Applied Imaging	Cytovision 3.93.1
Digital Camera	Olympus	UCMAD3
			IN SITU HYBRIDIZATION RECIPES Formamide Solutions 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamide* (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d2H20 pH to 7.0 with HCl (Sigma) * It is important to use formamide that has been stored at -20 °C. Prolonged room temperature storage will generate formic acid and the pH will be too low. 50% Formamide/2x SSC 25 ml formamide (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH2O pH to 7.0 with HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH2O to volume PN Buffer [0.1 M NaP04 0.1% NP_40 (Sigma)] Make a 0.1 M solution each of sodium phosphate (Filter sterilize and store in 500 ml aliquots). 0.1 M NaH2P04 , 1 L 13.8 g NaH2P04 (Sigma): dH2O to volume 0.1 M NaH2P04 1 L 14.2 g NaH2P04 (Sigma) dH2O to volume. PN: Adjust pH of 0.1 M Na2HP04 to pH 8.0 with .1 M NaH2P04. Filter sterilize and add 1 ml of NP-40. PNM 50 ml 1.25 g Non-fat dry milk (Sigma) 25 ml PN buffer (Recipe above) Mix for 15-20 min with constant stirring. Spin 2 times at 400 x g for 10 min. Use supernatant, and make sure not to disturb precipitated milk proteins.