Matrix-assisteret Autolog Chondrocyt transplantation for Remodeling og reparation af chondral Mangler i en kanin model
Summary
En eksperimentel teknik til behandling af chondrale defekter i kaninens knæled beskrives. Implantation af autologe chondrocytter podet på en matrix er et godt accepteret metode til remodellering og reparation af ledbrusk læsioner giver tilfredsstillende resultater på lang sigt. Matrix-assisteret autolog chondrocyt transplantation (MACT) tilbyder en standardiseret og klinisk etablerede implantation metode.
Abstract
Ledbrusk defekter betragtes som et stort sundhedsproblem, fordi ledbrusk har en begrænset kapacitet til selv-regeneration 1.. Ubehandlede brusklæsioner fører til løbende smerter, negativ indflydelse på livskvaliteten og prædisponere for slidgigt. I de seneste årtier har flere kirurgiske teknikker blevet udviklet til behandling af sådanne læsioner. Men indtil nu har det ikke været muligt at opnå en fuld reparation i form af dække defekten med hyalin ledbrusk eller levere tilfredsstillende langfristet genopretning 2-4. Derfor ledbrusken skader forbliver et oplagt mål for regenerative teknikker såsom Tissue Engineering. I modsætning til andre kirurgiske teknikker, som ofte fører til dannelsen af fibrøst eller fibrocartilaginous væv, sigter Tissue Engineering på fuldstændig genopretning den komplekse struktur og egenskaber af den oprindelige ledbrusk ved hjælp af chondrogene potentiale af transplanterede celler. RSENESTE udvikling åbnet lovende muligheder for regenerativ brusk behandlinger.
Den første celle tilgang til behandling af fuld tykkelse brusk eller osteochondral læsioner blev udført i 1994 af Lars Peterson og Mats Brittberg der var pioner klinisk autolog chondrocyt implantation (ACI) 5.. Dag, er teknikken klinisk veletableret til behandling af store hyaline bruskdefekter i knæet, opretholde gode kliniske resultater endda 10 til 20 år efter implantation 6.. I de seneste år, undergik implantation af autologe chondrocytter en hurtig progression. Anvendelsen af en kunstig tredimensional collagen matrix, på hvilken cellerne efterfølgende genplantet blev mere og mere populære 7-9.
MACT består af to kirurgiske procedurer: Først for at indsamle chondrocytter, en bruskbiopsi skal udføres fra et ikke vægtbærende brusk område than knæled. Derefter er chondrocytter bliver ekstraheret, renset og udvidet til et tilstrækkeligt antal celler in vitro. Chondrocytter podes derefter på en tredimensional matrix og kan efterfølgende genimplanteret. Ved udarbejdelsen af et vævs-manipuleret implantat, proliferation sats og differentiering kapacitet er afgørende for en vellykket vævsregenerering 10.. Anvendelsen af en tredimensional matrix som en celle bærer menes at støtte disse cellulære egenskaber 11.
Følgende protokol skal sammenfatte og demonstrere en teknik til isolering af chondrocytter fra brusk biopsier, deres proliferation in vitro og deres podning på en 3D-matrix (Chondro-Gide, GEISTLICH biomaterialer, Wollhusen, Schweiz). Endelig vil implantation af celle-matrix-konstruktioner i kunstigt skabte chondral defekter af en kanin knæled blive beskrevet. Denne teknik kan bruges som en eksperimentel indstillingtil yderligere eksperimenter brusk reparation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den præsenterede protokol giver en etableret 9,12,13 og nemt reproducerbar teknik til at isolere autologe chondrocytter til efterfølgende spredning og re-implantation i kunstigt skabte brusk defekter i kanin knæ. Anvendelsen af autologe chondrocytter for ombygning og reparation af ledbrusk læsioner er allerede i klinisk brug leverer tilfredsstillende resultater på lang sigt 6..
Store problemer for eksempel periosteal hypertrofi og forkalkning, graft delaminering el…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af den tyske Research Association (DFG, HE 4578/3-1).
Materials
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| Collagenase A | Roche | 10 103 586 001 | 0.21 U/mg |
| Fetal calf serum (FCS) | PAN Biotech GmbH | 3702-P103009 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2213 | 10,000 U/ml/10,000 μg/ml |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KgaA | 410230 | |
| Trypsin-EDTA 0.25 %/0.02 % | Biochrom AG | L2163 | in PBS w/o Ca2+, Mg2+ |
| Fentanyl | Delta Select GmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | Bbraun | 8333A193 | |
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma-Aldrich | L8154 | |
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
| Chondro-GideÒ | Geistlich Pharma AG | 30915.5 | |
| Biopsy Punch | pfm medical ag | 48351 | |
| Tissucol Duo S | Baxter | 3419627 | 0.5 ml |
References
- Albrecht, C., et al. Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study. Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).
- Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints. J. Bone Joint Surg. Br. 41, 618-619 (1959).
- Johnson, L. L. Arthroscopic abrasion arthroplasty historical and pathologic perspective: present status. Arthroscopy. 2, 54-69 (1986).
- Steadman, J. R., Rodkey, W. G., Singelton, S. B., Briggs, K. K. Microfracture technique for full-thickness chondral defects: technique and clinical result. Operat. Tech. Orthop. 7, 300-304 (1997).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Nehrer, S., et al. Chondrocyte-seeded collagen matrices implanted in a chondral defect in a canine model. Biomaterials. 19, 2313-2328 (1998).
- Frenkel, S. R., Toolan, B., Menche, D., Pitman, M. I., Pachence, J. M. Chondrocyte transplantation using a collagen bilayer matrix for cartilage repair. J. Bone. Joint Surg. Br. 79, 831-836 (1997).
- Salzmann, G. M., et al. The dependence of autologous chondrocyte transplantation on varying cellular passage, yield and culture duration. Biomaterials. 32, 5810-5818 (2011).
- Frohlich, M., Malicev, E., Gorensek, M., Knezevic, M., Kregar Velikonja, N. Evaluation of rabbit auricular chondrocyte isolation and growth parameters in cell culture. Cell Biol. Int. 31, 620-625 (2007).
- Willers, C., Chen, J., Wood, D., Xu, J., Zheng, M. H. Autologous chondrocyte implantation with collagen bioscaffold for the treatment of osteochondral defects in rabbits. Tissue Eng. 11, 1065-1076 (2005).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Ueblacker, P., et al. In vivo analysis of retroviral gene transfer to chondrocytes within collagen scaffolds for the treatment of osteochondral defects. Biomaterials. 28, 4480-4487 (2007).
- Marlovits, S., Zeller, P., Singer, P., Resinger, C., Vecsei, V. Cartilage repair: generations of autologous chondrocyte transplantation. Eur. J. Radiol. 57, 24-31 (2006).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Rudert, M., Hirschmann, F., Wirth, C. J. Growth behavior of chondrocytes on various biomaterials. Orthopade. 28, 68-75 (1999).
- Hsu, S. H., et al. Evaluation of biodegradable polyesters modified by type II collagen and Arg-Gly-Asp as Tissue Engineering scaffolding materials for cartilage regeneration. Artificial Organs. 30, 42-55 (2006).
- Brun, P., Cortivo, R., Zavan, B., Vecchiato, N., Abatangelo, G. In vitro reconstructed tissues on hyaluronan-based temporary scaffolding. J. Mater. Sci. Mater. Med. 10, 683-688 (1999).
- Domm, C., Fay, J., Schunke, M., Kurz, B. Redifferentiation of dedifferentiated joint cartilage cells in alginate culture. Effect of intermittent hydrostatic pressure and low oxygen partial pressure. Orthopade. 29, 91-99 (2000).
- Kimura, T., Yasui, N., Ohsawa, S., Ono, K. Chondrocytes embedded in collagen gels maintain cartilage phenotype during long-term cultures. Clin. Orthop. Relat. Res. , 231-239 (1984).
- Kon, E., et al. Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years. Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).
- Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).
- Niemeyer, P., et al. Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint. Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).
- Tay, L. X., et al. Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model. The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).
- Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes. Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).
