Behandling af osteochondral Fejl i kanin Knæleddet ved implantering af allogene mesenchymstamceller i fibrinkoagulater
Summary
En eksperimentel teknik til behandling af osteochondrale defekter i kaninens knæled beskrives. Implantation af allogene mesenkymale stamceller i osteochondrale defekter giver en lovende udvikling inden for tissue engineering. Fremstillingen af fibrin-celle-blodpropper<em> In vitro</em> Tilbyder en standardiseret metode til implantation.
Abstract
Behandlingen af osteochondrale artikulær fejl har været en udfordring læger i mange år. En bedre forståelse af samspillet mellem ledbrusk og subchondral knogle i de senere år ført til en øget opmærksomhed på restaurering af hele osteochondralt enheden. I forhold til chondral læsioner regenerering af osteochondrale defekter er langt mere kompleks og et langt større kirurgisk og terapeutisk udfordring. Det beskadigede væv omfatter ikke kun den overfladiske brusk lag, men også den subchondral knogle. For dyb, osteochondralt skader, som det forekommer for eksempel med osteochondrose dissecans den fulde tykkelse af defekten skal udskiftes for at genoprette den fælles overflade 1. Kvalificerede terapeutiske procedurer nødt til at overveje disse to forskellige væv med deres forskellige iboende helbredende potentiale 2.. I de seneste årtier har flere kirurgiske behandlingsmuligheder opstået og har allerede blevet klinisk etableret 3 –6..
Autologe eller allogene osteochondrale transplantater består af ledbrusken og subchondral knogle og tillade udskiftning af hele osteochondralt enhed. Manglerne er fyldt med cylindriske osteochondrale podninger, der har til formål at give en kongruent hyalinbrusk dækket flade 3,7,8. Ulemperne er den begrænsede mængde af tilgængelige poder, donor site morbiditet (for autologe transplantationer), og inkongruens af overfladen og derved anvendelsen af denne metode er særligt begrænset til store defekter.
Nye tilgange inden for tissue engineering åbnet lovende muligheder for regenerativ osteochondral terapi. Implantation af autologe chondrocytter markerede den første celle baseret biologisk metode til behandling af fuld tykkelse brusklæsioner og er nu på verdensplan etableret med gode kliniske resultater, selv 10 og 20 år efter implantation 9,10. Men date, denne teknik er ikke egnet til behandling af alle typer af læsioner, såsom dybe defekter involverer subchondral knogle 11..
Sandwich-teknik kombinerer knogletransplantation med nuværende tilgange i Tissue Engineering 5,6. Denne kombination synes at være i stand til at overvinde de begrænsninger, set i osteochondrale transplantater alene. Efter autolog knogletransplantation til subchondral defekt område, er en membran podes med autologe chondrocytter sutureres ovenfor og letter at matche topologi af implantatet med den beskadigede sted. Selvfølgelig skal den tidligere knoglerekonstruktion ekstra kirurgisk tid og ofte endda en ekstra operation. Hertil kommer, at dato er langsigtede data mangler 12.
Tissue Engineering uden yderligere knogletransplantation formål at genoprette den komplekse struktur og egenskaber af nativ ledbrusk ved chondrogen og osteogene potentiale af de transplanterede celler. However, igen, er det normalt kun brusk væv, der er mere eller mindre regenereres. Yderligere osteochondral skade har brug for en specifik yderligere behandling. For at opnå en regenerering af flerlagsstruktur af osteochondrale defekter, tredimensionale manipuleret væv podet med autologe / allogene celler kan give en god regenerationskapacitet 11.
Udover autologe chondrocytter, synes mesenkymale stamceller (MSC) for at være et attraktivt alternativ til udvikling af en fuld tykkelse bruskvæv. I talrige prækliniske in vitro og in vivo studier har mesenkymale stamceller viste fremragende vævsregeneration potentiale 13,14. Den vigtigste fordel ved mesenkymale stamceller især til behandling af osteochondrale defekter er, at de har kapacitet til at differentiere i osteocytter samt chondrocytter. Derfor er de potentielt give et flerlaget revitalisering af dindvirket.
I de senere år har flere stilladser med osteochondral regenerativ potentiale derfor blevet udviklet og evalueret med lovende foreløbige resultater 1,15-18. Endvidere fibrinklæber som en celle bærer blev en af de foretrukne teknikker i eksperimentel brusk reparation og er allerede med held blevet anvendt i adskillige dyrestudier 19-21 og endda første menneskelige forsøg 22.
Følgende protokol vil demonstrere en eksperimentel teknik til isolering af mesenkymale stamceller fra en kanin knoglemarv, til efterfølgende proliferation i cellekultur og til fremstilling af en standardiseret in vitro-model for fibrin-Cell-blodpropper. Endelig vil en teknik til implantering af forud fastsatte fibrin-celle-blodpropper i kunstige osteochondrale defekter i kaninens knæled blive beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I de seneste år, muligheden for at behandle komplekse artikulær osteochondrale defekter – blev med Tissue Engineering tilgange mere og mere attraktiv – såsom dem, der skyldes osteochondritis dissecans, osteonekrose og traumer. I de tidligere nævnte patologiske enheder, udvider vævsskader subchondral knogle og involverer to væv er kendetegnet ved forskellige iboende helbredende kapacitet 1.. Der er en stigende interesse i rollen som subchondral knogle for patogene processer osteochondral artikulær skade…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette projekt blev finansieret af den tyske Research Association (tilskud HE 4578/3-1), og delvist af FP7 EU-projekt "GAMBA" nMP3-SL-2010 til 245.993.
Materials
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).
- Hangody, L., et al. Autologous osteochondral grafting–technique and long-term results. Injury. 39, 32-39 (2008).
- Marcacci, M., et al. Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up. The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).
- Ochs, B. G., et al. Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee. The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).
- Aurich, M., et al. Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee. Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).
- Williams, R. J., Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).
- Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P. Mosaicplasty: long-term follow-up. Bull. Hosp. Jt. Dis. 63, 54-62 (2005).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Gomoll, A. H., et al. The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).
- Steinhagen, J., et al. Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes. Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).
- Guo, X., et al. Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model. Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).
- Centeno, C. J., et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 11, 343-353 (2008).
- Niederauer, G. G., et al. Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats. Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).
- Nagura, I., et al. Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold. J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).
- Schlichting, K., et al. Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing. The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).
- Schagemann, J. C., et al. Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model. Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Schillinger, U., et al. A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors. Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).
- Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).
- Haleem, A. M., et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 1, 253-261 (2010).
- Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone. Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).
- Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects. Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).
- Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).
- Chen, F. H., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases. Arthritis Res. Ther. 10, 223 (2008).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).
