섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료
Summary
토끼의 무릎 관절 연골 결손의 치료를위한 실험 기법을 설명합니다. 연골 결손에 동종 간엽 줄기 세포의 이식은 조직 공학 분야의 유망한 개발을 제공합니다. 섬유소 세포 혈전의 준비<em> 체외에서</em> 주입하기위한 표준화 된 방법을 제공합니다.
Abstract
연골 관절 결함의 치료는 몇 년 동안 의사를 도전하고있다. 최근 몇 년 동안 관절 연골과 연골 하골의 상호 작용의 이해는 전체 연골 단위의 복원으로 증가 관심을 이끌어 냈다. chondral 병변에 비해 골 연골 결손의 재생은 훨씬 더 복잡하고 훨씬 더 큰 수술 및 치료 도전입니다. 손상된 조직은 표면 연골 층뿐만 아니라 연골 하골에 포함되지 않습니다. 이 osteochondrosis의 dissecans로 예를 들면 발생할 때 깊은 골 연골 손상, 결함의 전체 두께는 접합면을 복원하기 위해 교체해야합니다. 자격 치료 절차는 서로 다른 고유의 치유 잠재력 2이 두 개의 서로 다른 조직을 고려해야합니다. 지난 수십 년 동안 여러 가지 수술 적 치료 옵션이 등장하고 이미 임상 3 설립되었습니다 –6.
자가 또는 동종 골 연골 이식은 관절 연골과 연골 하골의 구성 및 전체 골 연골 장치의 교체를 할 수 있습니다. 결함 표면 3,7,8 덮여 합동 유리 모양의 연골을 제공하는 것을 목표로 원통형의 골 연골 이식으로 채워집니다. 단점 사용할 이식, 공여부 이환율 (자가 이식)과 표면의 부조화의 제한되며 따라서이 방법의 응용 프로그램은 특히 큰 결함이 제한됩니다.
조직 공학 분야에서 새로운 접근이 재생 연골 치료에 유망한 가능성을 열었다. 자가 연골 세포의 이식은 전층 연골 병변의 치료를위한 첫 번째 셀을 기준으로 생물학적 접근 방식을 표시하고 현재 전세계도 10~20년 주입 9,10 후에 좋은 임상 결과와 함께 설정됩니다. 그러나 다에테이 기술은 연골 뼈 11을 포함하는 깊은 결함으로 병변의 모든 종류의 치료에 적합하지 않습니다.
샌드위치 기술은 조직 공학 5,6에서 현재의 접근 방식에 이식 뼈를 결합합니다. 이 조합은 혼자 연골 이식에서 보이는 한계를 극복 할 수있을 것 같습니다. 연골 결손 영역에 이식자가 골 후,자가 연골 세포와 시드 막 위 봉합 및 부상 사이트에 이식 토폴로지에 맞게 용이합니다. 물론, 이전의 뼈 재건은 추가 수술 시간과 자주도 추가 수술이 필요합니다. 또한, 현재까지 장기간 데이터가 12이 없습니다.
이식 추가 골없이 조직 공학 이식 세포의 연골 및 골 형성 가능성 인디언 관절 연골의 복잡한 구조와 특성을 복원하는 것을 목표로하고있다. HoweveR은 다시, 그것은 일반적으로 더 많거나 적은 재생에만 연골 조직이다. 추가 골 연골 손상은 특정 추가 처리가 필요합니다. 동종 /자가 세포를 파종 골 연골 결손의 다층 구조의 재생을 달성하기 위하여, 입체 조직 설계 제품은 좋은 재생 능력 11 제공 할 수 있습니다.
자가 연골 옆에 중간 엽 줄기 세포 (MSC)는 전층 연골 조직의 개발을위한 매력적인 대안이 될 것으로 보인다. 다수의 전임상 시험 관내 (in vitro)과 생체 내 연구에서, 중간 엽 줄기 세포는 뛰어난 조직 재생 가능성 13,14을 표시했다. 특히 연골 결손의 치료를위한 중간 엽 줄기 세포의 중요한 장점은 골 세포뿐만 아니라 연골 세포의 분화 할 수있는 능력을 가지고있다. 따라서, 그들은 잠재적 D의 다중 재생을 허용EFECT.
최근 몇 년 동안, 연골 재생 잠재력을 가진 여러 비계 따라서 개발되어 예비 결과에게 1,15-18을 약속으로 평가. 또한, 휴대 캐리어와 같은 섬유소 접착제 실험 연골의 기본 기술 중 하나가되었고 이미 성공적으로 여러 동물 연구에서 19-21, 심지어 최초의 인간 실험 22 사용되었습니다.
다음 프로토콜은 세포 배양의 후속 증식과 섬유소 세포 혈전에 대한 체외 모델에서 표준을 준비, 토끼의 골수에서 중간 엽 줄기 세포를 분리하는 실험 방법을 보여줍니다. 마지막으로, 토끼의 무릎 관절의 인공 연골 결손에 미리 설정된 섬유소 세포 혈전 주입하는 기술을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
최근 몇 년 동안, 복잡한 관절 연골 결손 치료의 가능성 – 같은 osteochondritis의 dissecans, 괴사와 외상으로 인한 것과 같은이 – 조직 공학 방법으로는 더 매력적되었다. 앞서 언급 한 병리 기관에서 조직 손상은 연골 뼈까지 확장 서로 다른 고유의 치유 능력 1 특징으로 두 개의 조직을 포함한다. 연골 관절 손상 11,23의 병원성 프로세스 연골 하골의 역할에 대한 관심이 증가가 있습니다….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 프로젝트는 독일 연구 협회 (부여 HE 4578/3-1)에 의해 부분적으로 FP7 유럽 연합 (EU) 프로젝트 "감바"NMP3-SL-2010-245993에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of reagent/equipment | Company | Catalogue Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).
- Hangody, L., et al. Autologous osteochondral grafting–technique and long-term results. Injury. 39, 32-39 (2008).
- Marcacci, M., et al. Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up. The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).
- Ochs, B. G., et al. Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee. The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).
- Aurich, M., et al. Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee. Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).
- Williams, R. J., Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).
- Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P. Mosaicplasty: long-term follow-up. Bull. Hosp. Jt. Dis. 63, 54-62 (2005).
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Gomoll, A. H., et al. The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).
- Steinhagen, J., et al. Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes. Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).
- Guo, X., et al. Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model. Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).
- Centeno, C. J., et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 11, 343-353 (2008).
- Niederauer, G. G., et al. Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats. Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).
- Nagura, I., et al. Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold. J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).
- Schlichting, K., et al. Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing. The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).
- Schagemann, J. C., et al. Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model. Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Schillinger, U., et al. A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors. Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).
- Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).
- Haleem, A. M., et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 1, 253-261 (2010).
- Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone. Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).
- Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects. Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).
- Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).
- Chen, F. H., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases. Arthritis Res. Ther. 10, 223 (2008).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).
