Bildanalys av neuron till Glia interaktion i mikroflödessystem Kultur Platform (MCP)-baserade neuronal Axon och Glia samodlingssystemet
Summary
Denna studie beskriver förfaranden för att inrätta en ny neuronal axon och (astro) Glia samodling plattform. I denna samodlingssystemet blir manipulering av direkt interaktion mellan en axon (och enda gliaceller) genomförbart, så mekanistiska analys av ömsesidiga neuron till gliala signalering.
Abstract
Korrekt neuron till glia växelverkan är kritisk för fysiologisk funktion hos det centrala nervsystemet (CNS). Denna dubbelriktad kommunikation är sofistikerat förmedlas av specifika signalvägar mellan neuron och glia 1,2. Identifiering och karakterisering av dessa signalvägar är avgörande för förståelsen av hur neuron till Glia interaktion former CNS fysiologi. Tidigare har neuron och glia blandade kulturer har allmänt används för att testa och karakterisera signalvägar mellan neuron och glia. Vad vi har lärt oss av dessa preparat och andra in vivo-verktyg har dock föreslagit att ömsesidiga signalering mellan neuron och glia ofta förekommit i vissa fack inom neuroner (dvs. axon, dendrit eller soma) 3. Detta gör det viktigt att utveckla en ny kultur som gör det möjligt separation av neuronala fack och specifikt undersöker samspelet mellan glia och neuronella axoner / dendriter. Dessutom, är det konventionella blandade kulturen systemet inte kan differentiera de lösliga faktorer och direkta membran signaler kontakt mellan neuron och glia. Dessutom saknar den stora mängden av neuroner och gliaceller i det konventionella samodlingssystemet den upplösning som krävs för att observera samspelet mellan en enda axon och en gliacell.
I denna studie beskriver vi en ny axon och glia samodlingssystemet med användning av en mikrofluidisk kultur plattform (MCP). I denna samodlingssystemet är neuroner och gliaceller odlades i två separata kammare som är anslutna via flera centrala kanaler. I denna mikroflödessystem kultur plattform, kan bara neuronala processer (särskilt axoner) Ange gliaceller sidan genom de centrala kanalerna. I kombination med kraftfulla fluorescerande protein märkning tillåter detta system direkt undersökning av signalvägar mellan axonala / dendritiska och gliaceller interaktioner, sådans axon-medierad transkriptionell reglering i glia, Glia-medierad receptor handel med neuronala terminaler och glia-medierad axon tillväxt. Den smala diametern av kammaren också signifikant förbjuder flödet av neuron-anrikat medium i gliala kammaren, underlättar sondering av direkta membran-protein-interaktion mellan axoner / dendriter och glia ytor.
Protocol
Representative Results
Discussion
MCP baserade neuron och astrocyter samodlingssystemet tillåter dissektion av detaljerade neuron till astroglia signalvägar genom att endast axoner passerar de centrala kanalerna och interagera med astrogliaceller. Denna samodlingssystemet kan enkelt ställa upp med konventionell neuron och astrocyt förfaranden kultur. Vi beskrev också en praktisk tillämpning av denna samodlingssystemet genom att använda en EGFP baserad reporter för att visa axon-beroende aktivering GLT1 promotor i astrocyter.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr Jeffrey Rothstein för att ge BAC GLT1 EGFP möss och GLT1 antikropp, Tufts Center for Neuroscience Research (NIH P30 NS047243, PI, Rob Jackson) för att tillhandahålla värdefulla core faciliteter, ny fakultet rekrytering bidrag (NIH P30 5P30NS069254-02 , PI, Phil Haydon) i Tufts neurovetenskap Institutionen.
Materials
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 | for plating neuron for neuron cutlure medium |
| Fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F4135 | for astrocyte culture medium |
| Glial derived nerve factor | R&D systems | 212-GD | Apply 10-20 ng/ml to neuron side of chamber |
| Dulbecco modified eagle medium high glucose | Sigma-Aldrich | 11995 | |
| 70 mm cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Sterile glass bottom dish | MatTek Corporation | ||
| Microfluidic culture platforms | Xona Microfluidics LLC | SND150 | |
| 6 wells of the culture plate | Cellstar | 657 160 | |
Neuron culture medium
|
|||
|
Neuron culture medium for plating cell
|
|||
|
Astrocyte culture medium
|
|||
|
Table 1. Materials used in the microfluidic culture platform-based neuronal axon and glia co-culture system. |
References
- Stevens, B. Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits. Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).
- Paixao, S., Klein, R. Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity. Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).
- Fields, R. D., Stevens-Graham, B. New insights into neuron-glia communication. Science. 298, 556-562 (2002).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature. 1, 2128-2136 (2006).
- Wang, C. Y. Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin. The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).
- Yang, Y. Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1. Neuron. 61, 880-894 (2009).
- Regan, M. R. Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS. The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).
- Swanson, R. A. Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes. The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).
- Schlag, B. D. Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons. Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).
- Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state. Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).
- Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation. Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60, 430-440 (2008).
- Debanne, D., Rama, S. Astrocytes shape axonal signaling. Science signaling. 4, pe11 (2011).
