连续光漂白划定单雪旺细胞在神经肌肉接头处
Summary
可视化的单个细胞密集的组织，如终端雪旺氏细胞（SC）的神经肌肉接头（NMJs），是具有挑战性的。 “连续光漂白”可以划定单一的终端南海，例如在的三角sterni肌肉外植体，方便神经肌肉准备，连续的漂白可以结合时间推移成像<em>事后</em> immunostainings。
Abstract
顺序光漂白在NMJ标记个别SC的，提供了一种非侵入性的方式。 NMJ是世界上最大的哺乳动物神经系统的突触，并担任指导模式研究突触的结构和功能。电机轴突在鼠标NMJs的终端形成与肌纤维的椒盐卷饼般的接触位点。公务员事务局局长电机轴突和终端的护套。在过去的几十年里，转基因小鼠已产生运动神经元和SC可视化，例如大鼠Thy1-XFP和PLP-GFP小鼠，分别。
沿着运动神经元轴突，髓鞘轴索SC的配置在非重叠的节间，分离由节点朗维埃，启用跳跃动作电位传播。相比之下，公务员事务局局长的突触终端是专门的神经胶质细胞，监督和促进神经传导，消化碎片和引导轴突再生。的NMJs盖好了半打非MYELinating端子SC的- ，但是，这些不能被单独用光学显微镜解决，因为它们是在直接膜接触3。
有几种方法可以单独可视化终端种姓。这些都不是完美的，虽然。例如，染料填充，单细胞染料填充微刺穿，需要摧毁了标记的细胞，然后再填充第二个。与随后的时间推移录音3，这是一个不兼容。多光谱“Brainbow”标签的判已经实现，通过使用组合的荧光蛋白的表达4。然而，该技术需要结合几个转基因和限制使用的启动子的表达模式。在未来，“照片切换的”蛋白质在SC的表达可能会对又一替代5。在这里，我们提出了连续的光漂白，漂白单细胞，和自己的形象得到减法。我们相信，这种方法-由于其易用性和多功能性-代表持久除了神经学家的技术调色板，特别是因为它可以在体内使用，转移到其他类型的细胞，解剖部位或物种6。
在下面的协议，我们详细的应用顺序漂白时间的推移和随后的共聚焦显微镜终端公务员事务局局长的三角sterni肌肉植。这本薄薄的，肤浅的，容易解剖神经肌肉准备7,8证明是有益的研究NMJ发展，生理和病理9。最后，我们解释了如何的三角sterni肌肉固定后准备执行相关的高解析度激光共聚焦成像，免疫组化或超微结构检查。
Protocol
Representative Results
Discussion
SC漂白这里介绍的方法很简单，速度快，通用性：（一）它使一个单一的基因-这是一个显着的优势相结合的方法， 例如需要额外的基因与疾病模型，激光共聚焦显微镜的基础上揭示单SC形态和动态。 （ii）该方法具有快速，从解剖，以固定它可以在半天的时间。 （ⅲ）的应用程序的数目是广泛的，因为它可以与其他方法，如细胞消融，成像的细胞器，电生理学或免疫组织化学结合。此外?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢曼努埃拉·布达克，Ljiljana Marinkovi和克里斯蒂娜Wullimann的，为优秀的技术援助。我们感谢W.麦克林提供PLP-GFP小鼠。 TM高级研究所（慕尼黑工业大学），德意志研究联合会（DFG Sonderforschungsbereich SFB 596），亚历山大冯洪堡基金会支持，由国家提供资金的机构（的“Bundesministerium献给教化和Forschung” ）ERA-净神经元“iPSoALS”和“2 – 光子成像”中的帧的。 TM和MB支持由集成蛋白质科学中心（慕尼黑）。 PM由研究生院的慕尼黑工业大学（TUM-GS）的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company (example) | Catalogue number | Comments (optional) |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer’s solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
References
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