Summary
现在的光遗传学的发展提供了手段精确地刺激基因定义的神经元和电路，既
Abstract
阐明神经元的连接模式一直是临床和基础神经科学的一个挑战。电已经分析模式的突触连接的金标准，但配对的电生理记录可以既繁琐和实验限制。光遗传学的发展引入一个优雅的方法来刺激神经 元和电路中，无论是在体外和在体内 2,3。通过利用驱动视蛋白表达的离散的神经元群体的细胞类型特异性的启动子活性，其中一个可以精确地刺激基因定义的神经元的亚型，在不同的电路4-6。很好的描述的方法，以刺激神经元，包括电刺激和/或药理操纵，往往型细胞不加区别，侵入性的，并且可能会损坏周围组织。这些限制可能会改变正常的突触功能和/或电路的行为。此外，由于操纵的性质，目前的方法通常是急性的和终端。光遗传学得到的能力，以刺激神经元的相对无害的方式，而在转基因的目标神经元。 体内光遗传学研究，涉及的大多数目前使用的是通过植入插管6,7引导的光纤，但是，这种方法的局限性包括受损的脑组织与重复插入的光纤，和潜在的断裂的纤维内部的套管。由于光遗传学领域的蓬勃发展，更可靠的方法，以方便长期研究，以最小的附带组织损伤的慢性刺激是必要的。在这里，我们提供我们修改后的协议作为视频文章补充的方法，有效和优雅的描述斯巴达等 。的麻醉小鼠的头盖骨上的光纤植入物和其永久固定的制作，以及组装的纤维植入物连接到光纤耦合器的光源。的植入物，与光纤连接的固态激光器，允许一个有效的方法，对长期photostimulate功能的神经元的电路与使用小型，可拆卸的，系绳的组织破坏少9。永久固定的光纤植入提供稳定，长期在体内 optogenetic清醒，行为10用最少的组织损伤小鼠的神经回路的研究。
Protocol
*所有材料连同各自的制造商和/或供应商下面列出的协议。
1。大会植入
- 准备光纤的热固化性环氧树脂的混合物，通过添加固化剂，100毫克1克树脂。
- 测量并削减约35毫米的125微米的光纤，100微米的核心，它的楔尖硬质合金划线得分。文士垂直放置在一个单一的，单向运动的光纤和得分。切割纤维将完全损坏的光纤纤芯。
- 插入一个LC陶瓷插芯钻入副为127微米，凸侧朝下。
- 插入到套圈的光纤。光纤应顺利滑动，和边缘伸出的凸端的套箍（ 图1a）。
- 应用一滴的热固化性的光纤环氧树脂的平坦的端部和热用热枪直到变成黑色环氧树脂。环氧填充，因为它被加热并在固化前的套圈。环氧固化在1分钟之内的恒热应用。
- 清理任何环氧树脂沿着套圈的两侧，它会妨碍与联接器的接口。
- 波兰语氧化铝抛光垫的抛光表上（ 图1b）上的套圈用LC光纤抛光的光盘（FOPD）的凸端。圆形旋转图案和抛光四个等级按以下顺序：5，3，1 0.3微米砂砾。
- 切割到适当的长度，使得它的目标感兴趣的区域的平坦的端的光纤。长度可以采用脑立体定位图谱确定。
- 测试植入物，通过将其连接到所述激光通过下面描述的耦合器线。抛光的植入物的端部插入到耦合器的套筒，并应使直接接触相对的套箍。的植入物应能保持10毫瓦的光输出，测量的尖端处的第Ë植入物纤维。一个坏的植入物将光纤的前端附近有一个弱的焦点。
- 存储成品植入物（ 图1c）的泡沫，直到使用。
2。大会的光纤连接器电源线
- 准备上述光纤的热固化性环氧树脂的混合物。
- 测量和切成适当的长度为220μm的光纤200微米的核心，它的楔尖硬质合金划线得分。纤维的长度应允许自由移动鼠标周围的外壳，但不允许鼠标咀嚼通过光纤。
- 插入到分叉管的长度略长于光纤的光纤长度。管应当具有比光纤的内径稍大。
- 地带〜25毫米的光纤的一端，将其插入到多模FC MM的金属端套圈组件与230微米孔，直到它停止。光纤应坚持通过ferru乐端（ 图2a）。
- 氰基丙烯酸酯（超级胶水）的金属端固定连接。覆盖与连接器引导和打磨套圈端与FC FOPD。进行圆形旋转模式和抛光四个等级顺序如下：5，3，1，0.3微米粒度（ 图2b）。
- 剥去，并插入成LC陶瓷插芯（230微米内径孔）与凸状端部的前端的光纤的另一端。环氧树脂平端和热滴一滴，直至痊愈。
- 波兰语的凸端的套箍上使用FC FOPD氧化铝抛光表如上所述。
- 滑动一个LC的套箍套筒超过凸状的端部的套圈，直到套筒的中点。
- 地点热缩管在分叉管，套管和热安全和保护的连接（ 图2c）。
- 测试的耦合器，通过将其连接到所述激光源和测量的光的OUTPUT斯达康通过耦合器，用分光光度计。之间的激光输出与测得的耦合器输出的光损失应不超过30％。
3。植入手术
*这是一个提示程序。仪器是无菌的，但不需要手套是由于不断操作仪器和设备之间的。
- 麻醉的小鼠腹膜内注射氯胺酮/赛拉嗪的混合物100和10毫克/公斤，分别使用30号针头。
- 电推剪，刮头皮。擦拭头皮其次由Betasept擦拭（4％的氯己定溶液），2分钟，重复一次，用70％异丙醇。
- 将鼠标在sterotaxic钻机及固定头，确保头骨水平。眼药膏眼睛，防止干燥和术后疼痛。根据“谅解备忘录”的生理状态与氧气的稀释挥发的异氟醚（1-3％，维持麻醉本身，应持续监测响应的尾部捏）。
- 通过中线的头皮做一个切口，暴露颅骨眼轨道的lambda。推开结缔组织是必要的。
- 塞拉芬夹来保存肌肤，保持访问头盖骨（ 图3a）。
- 蚀刻与牙科采撷头盖骨的整个表面的方格图案。清洗碎片用无菌生理盐水。彻底干燥。
- 过氧化氢（3％）的暴露颅骨，用棉签〜2-3秒微孔。多次洗净并晾干。此外，锚可以拧入头盖骨，作为斯巴达等中描述的。 （2012年）。
- 同样，蚀刻的整个头骨与牙齿挑方格图案和用生理盐水洗去杂物。彻底干燥。
- 使用的旋转工具，使一个小的毛刺孔开颅（<1毫米直径），用无菌钻头（灭菌）以上该地区的利益，脑立体定位图谱校准前囟门和lambda确定。要小心，不要破坏硬膜任何组织或损坏。洗去杂物，彻底晾干。
- 光纤套箍（植入物）插入到探头保持器，并连接到立体定位臂。
- 代替直接上方的感兴趣的区域，使用立体定位臂（ 图3b）中的植入物定位。如果插入的脑组织中的光学纤维，纤维应在〜2毫米/分钟的速率缓慢前进。本的套圈应休息的剩余头盖骨。
- 准备牙科水泥的混合物。该混合物应具有足够低的粘度，很容易地适用于头盖骨。混合物将可用于2-4分钟。
- 用无菌牙签，应用薄，甚至跨头盖骨和到植入物的下部层的牙科用粘固剂。牙科水泥的基础层应覆盖尽可能多的表面区域的颅骨可能。与皮肤接触的鼠标，不要让牙齿水泥。这将导致增加困难缝合以及刺激鼠标。如果牙科用粘固剂不进入与皮肤接触，允许它的部分干燥，使得整个层的水泥可以设定前剥离。
- 允许将其完全晾干。
- 甚至应用层的牙科水泥和种植体周围形成一个小土丘头盖骨，让每个层完全干燥（ 图3c）。离开〜3-5毫米的凸端的套圈干净的水泥，以便顺利，通畅的连接。
- 在土堆的牙科水泥和植入物周围使用无菌，一次性使用的丝绸编织缝合线（6-0）用C22针，缝合头皮。删除后7天。可选：使用兽医缝合后的其他具有约束力的债券。要确保使用最小的兽医债券的。过量可导致严重的皮肤损害，因搔抓。
- 立即出现Ŷ手术后，鼠标应皮下注射与Ketprophen（5毫克/公斤），以减少术后疼痛。这应24小时后重复。外用止痛剂（布比卡因）和抗生素（抗生素软膏）应用缝合的皮肤的植入物和周围的基。
- 关在笼子里加热毯将鼠标从麻醉中恢复。将鼠标在无菌术，术后恢复笼。恢复笼子里不应该包含任何床上用品，以保持温度，避免窒息。鼠标可以返回到原来的笼子或新的笼一次清醒。
正确的组装的光纤植入物和耦合器的查询结果在光源和在感兴趣的区域中的光纤的端部之间的最小光子损耗。精心打磨的光纤传输光在一个统一的，同心圆（ 图2d）。经过仔细的注入和缝合，植入物不会造成明显的刺激鼠标和没有任何显着降解的光纤或透射的光量为长期的研究（ 图3d，> 1个月，未发表的观测）可以留在原地。注入或缝合不当可引起刺激，并可能导致在鼠标刮伤通过其头皮，露出的牙科用粘固剂，或破损，从牙科用粘固剂的套圈由于持续的操纵。 图4可以看出，在组装的系统的示意性框图。
图1。大会的植入式光纤。 （a）在光纤插入套箍，略微伸出的箭头所表示的凸端。 （b）在凸端的套箍使用FOPD上逐渐变细的等级的抛光表抛光。 （三）成品植入纤维的选择IC。 点击这里查看大图 。
图2。大会使用的光纤耦合器，光纤旋转接头系绳给植入物。 （一）光纤通过环箍组装体的粘附。 （b）在套箍的装配侧插入FOPD和抛光使用逐渐变细的等级的研磨纸。 （c）在套箍套筒装配在套箍和热缩管固定。 （d）在完成的光纤耦合器应该产生的同心的光以最小的光子损耗。
图3。外科手术植入的光纤。 （a）在整个表面的cranium的暴露和结缔组织被清零。 （b）在与立体定位臂的位置被保持在光纤植入。 （三）牙科水泥固定光纤植入到头骨。 （D）植入后1个月，皮肤愈合植入物周围，没有任何迹象的刺激。
图4的功能的系统的示意图。
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Discussion
光遗传学是一个功能强大的新技术，使特定的神经元亚型前所未有的控制。这可以被利用来调节神经回路的解剖和时间精度，同时也避免了细胞类型不分青红皂白，通过电极的电刺激侵袭作用。植入的光纤允许一致的，慢性刺激的神经回路在多个会话中保持清醒，用最少的组织损伤的小鼠行为。该系统最初是由斯巴达等 。和修改，以适应我们的目的，进了一步超越了植入套管和修复光纤在该地区的利益，以确保一致的目标之间在长期研究的会议。植入物可以适于刺激不同区域的大脑。
在此方法中的各个步骤需要的精度和对细节的关注。光纤耦合的每个交界处是一定抛光，以确保最小的光损耗。抛光后，其两端进行检查，在显微镜下，以验证有没有损坏的光纤芯。如果光损耗之间的源极和测得的输出超过30％时，每个部分应重新磨光以允许最大的光子通量或该部分应丢弃并重拍。如果套圈入套筒不会滑动，有可能碎片内的套筒阻碍的套圈。当安装和除去耦合器线连接到植入物，应直接施加力的植入物的轴线平行。由于哺乳动物组织的散射光大量的蓝色光的能量和相对低的，所述植入物应被定位，使得纤维的前端的是500微米内的感兴趣的区域，这样的事实：在初始光的功率密度的> 10％的仍然存在。在植入过程中，牙科用粘固剂的基材层是关键的一步，因为它是这层固定植入物的CRANIUM。后续层的植入物固定到基材层，并提供保护。如果头盖骨是没有完全干透的基础层不会坚持，如果不遵守任何部分，它很可能是从鼠标操作打跑了整个植入。另外，牙科用粘固剂的锚可以拧入头盖骨，以进行更安全的夹具。
在行为学研究中，外部光线的泄漏，可能提供一个意想不到的提示，鼠标。外部光泄漏是最有可能发生在线直接在鼠标的植入物和耦合器之间的连接。为了尽量减少漏光，可以进一步扩展的热收缩管，使得它完全覆盖套圈套筒，以提供额外的防渗漏屏蔽。如果此选项追求，热缩管将覆盖在袖子里的窗口，提供视觉反馈的套圈之间的直接接触和接触，应确定与触觉费dback。
实现这种技术的进一步发展，它可以植入多个光纤到一个单一的鼠标使用额外的立体手臂，在斯巴达等 8。这将使得更复杂的研究，通过的时间特定的方式或同时刺激不同地区的在同一地区的不同的波长刺激。此外，光纤耦合与的电极（optrode） 体内电的局部刺激和记录。
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Acknowledgments
我们想承认，这种技术最初所描述的斯巴达等 ，2012年，并很容易地被使用在我们的实验室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9" x 13" 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1x1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2"(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2"(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5"Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
References
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