העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Summary

שיטה פשוטה לגזור ולשמור גזע spermatogonial ושורות תאי אב מעכברים בוגרים מוצגת כאן. השיטה מנצלת תאים מזינים שמקורם מתא תא סומטי מאשכי העכברים הבוגרים. טכניקה זו היא ישימה זנים נפוצים, כוללים עכבר מהונדס מוחץ, ולדפוק בעכברים.

Abstract

גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) של האשך מייצגים דוגמה קלסית לתאי גזע של יונקי בוגרים ולשמר פוריות לכמעט כל החיים של בעלי החיים. בעוד המנגנון המדויק ששולט בהתחדשות עצמית ובידול in vivo מאתגר למחקר, מערכות שונות שפותחו בעבר כדי להפיץ SSCs Murine במבחנה באמצעות שילוב של אמצעי תקשורת תרבות מיוחד ותאים מזינים ^1-3.

רוב הגיחות במבחנה לביולוגיה של SSCs שנבעו משורות תאי ילודים, אולי בשל הקושי בהשגת שורות תאי בוגרים ^4. עם זאת, האשך ממשיך להבשיל עד ~ 5 שבועות של גיל ברוב הזנים של עכברים. בתקופה הראשונה שלאחר הלידה, שינויים דרמטיים בארכיטקטורה של האשך ובביולוגיה של תאים והן גופניים spermatogenic, כוללים שינויים ברמות הביטוי של גזע רב הקשור לתאגנים. לכן, קווי SSC נגזרים-neonatally לא יכולים לסכם באופן מלא את הביולוגיה של SSCs המבוגר כי נמשך לאחר האשך המבוגר הגיע למצב יציב.

מספר גורמים שעכבו את הייצור של קווי מבוגרי SSC מבחינה הסטורית. ראשית, חלקם של תאי גזע פונקציונליים עשוי לרדת במהלך הבגרות, או בשל גורמים פנימיים או חיצוניים ^5,6. יתר על כן, כמו בתאי גזע בוגרים אחרים, זה כבר קשה להעשיר SSCs מספיק תאים מאשכים בוגרים כלל ללא שימוש בשילוב של אסטרטגיות מיון immunoselection או אחרות ^7. אסטרטגיות מועסק נפוץ כוללות שימוש בעכברים טמירים כמקור לתאי תורם בשל יחס גבוה יותר של תאי גזע לתאים מסוגים אחרים ^8. בהתבסס על ההשערה כי הסרת תאים הסומטיים מהתרבות הראשונית משבשת אינטראקציות עם נישת תאי הגזע שהם חיוניים להישרדות SSC, פתחו שיטות עבר כדי להפיק ליטר מבוגראינס, שאינו דורש immunoselection או תורמים טמירים אלא להעסיק העשרה סידורית של SSCs בתרבות, המכונה להלן כSESC ^2,3.

השיטה המתוארת להלן כרוכה הליך פשוט לגזירת קווי SSC במבוגרי dissociating תורם המבוגר seminiferous tubules, ואחריו ציפוי של תאים במתקני ההאכלה המורכבות משורת אשכי סטרומה תא (JK1) ^3. דרך סידורי passaging, חזק נדבק, לזהם תאי ניבט שאינו מתרוקנים מהתרבות עם העשרה קשורה של SSCs. תרבויות שנוצרו בדרך זו מכילות תערובת של spermatogonia בשלבים שונים של התמיינות, המכילות SSCs, המבוסס על יכולת התחדשות עצמית לטווח ארוך. עיקרה של שיטת SESC הוא שהוא מאפשר SSCs לבצע את המעבר הקשה מהתחדשות עצמית in vivo להתחדשות עצמית לטווח ארוך במבחנה בmicroenvironment שונה בתכלית, מייצר קווי SSC לטווח ארוך, ללא זיהוםתאים הסומטיים, ובכך מאפשר מניפולציה ניסויית הבאה של SSCs.

Protocol

1. הכנת תאי Feeder שים לב שכל המגיבים המתוארים להלן צריכים להיות מוכנים בצורה סטרילית (ראה לוחות 1 ו 2). פרוטוקול זה מעסיק שורת תאי JK1 (Cell Biolabs, Inc, קטלוג # CBA-315) כמאכילים שהוא נגזר הפך לתאים בוגרים עכבר אשכים סומטיות וכבר תארו במקום…

Representative Results

הופעתו של זן בר חלוף אפס, מושבות בוגרות SSC לאחר 7 ימים מוצגת באיור 1. מושבות תלת ממדיות מורכבות משכבה של תאים שטוחים המחוברים למתקני ההאכלה או המטריצה ​​זוטרה תאית שהפקידו את מתקני ההאכלה בשכבות מרובות של SSCs גידול בראש. בעוד SSCs הבריא הם בהיר ואחיד refractile 11-12 קו?…

Discussion

שיטה זו להפקת SSCs המבוגר באמצעות תאים מזינים המופקים מאשך למבוגרים היא חזקה והצליחה כאשר רקע גנטי משותף (למשל FVB, C57Bl6 ו129SV/C57Bl/6 המעורב) וזנים מוטנטים שונים הועסקו ^2,3,7,14. למעשה, microenvironment נוצר על ידי מערכת התרבות הוא מספיק כדי להתגבר על כמה מהמחסומים הגנטיים לשמ?…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.