Serial Anrikning av Spermatogonial Stem og stamceller (SSCS) i Kultur for Utledning av langsiktige Voksen Mus SSC Lines

Summary

En enkel metode for å utlede og vedlikeholde spermatogonial stilk og progenitor cellelinjer fra voksne mus er presentert her. Metoden utnytter mater celler stammer fra det somatiske celle kupé av de voksne mus testis. Denne teknikken gjelder vanlige musestammer, inkludert transgene, knock-out, og knock-i mus.

Abstract

Spermatogonial stilk og progenitor celler (SSCS) av testis representerer et klassisk eksempel på voksne pattedyrceller stamceller og bevare fruktbarheten for nesten levetiden av dyret. Mens de nøyaktige mekanismene som styrer selvfornyelse og differensiering in vivo er utfordrende å studere, har ulike systemer blitt utviklet tidligere for å spre murine SSCS in vitro ved hjelp av en kombinasjon av spesialiserte kultur media og mater celler ^1-3.

De fleste in vitro forays i biologi SSCS har avledet cellelinjer fra nyfødte, muligens på grunn av problemer med å skaffe voksne cellelinjer ^4. Men fortsetter testis å modne frem ~ 5 ukers alder i de fleste muselinjer. I den tidlige barsel, dramatiske endringer i arkitekturen av testis og i biologi både somatiske og spermatogenic celler, inkludert endringer i uttrykket nivåer av mange stamcelle-relatertegener. Derfor kan neonatally-avledet SSC linjer ikke fullt rekapitulere biologi voksne SSCS som vedvarer etter at voksen testis har nådd en stabil tilstand.

Flere faktorer har hindret produksjonen av voksne SSC linjer historisk. Først, kan andelen av funksjonelle stamceller minke under voksenlivet, enten på grunn av indre eller ytre faktorer ^5,6. Videre, som med andre voksne stamceller, har det vært vanskelig å berike SSCS tilstrekkelig fra total voksne testikkelceller uten å bruke en kombinasjon av immunoselection eller andre sortering strategier ^7. Vanligvis benyttes strategier omfatter bruk av cryptorchid mus som en kilde for donorceller grunnet en høyere andel av stamceller til andre celletyper ^8. Basert på hypotesen om at fjerning av somatiske celler fra den første kulturen forstyrrer interaksjoner med stamcelleforskningen nisje som er avgjørende for SSC overlevelse, vi tidligere utviklet metoder for å utlede voksen lines som ikke krever immunoselection eller cryptorchid givere, men heller ansette seriell anrikning av SSCS i kultur, heretter kalt SESC ^2,3.

Metodene beskrevet under innebærer en enkel prosedyre for å utlede voksen SSC linjer ved dissociating voksen donor seminiferøse tubuli, etterfulgt av plettering av celler på forer består av en testicular stromal cellelinje (JK1) ^3. Gjennom seriell passaging, sterkt tilhenger, forurensende ikke-kjønnsceller er oppbrukt fra kultur med samtidig anrikning av SSCS. Kulturer produsert på denne måten inneholder en blanding av spermatogonier på ulike stadier av differensiering, inneholder hvilke SSCS, basert på langsiktig selvtillit fornyelse evne. Crux av SESC metoden er at den gir SSCS ta den vanskelige overgangen fra selvfornyelse in vivo til langsiktig selvfornyelse in vitro i en radikalt annerledes mikromiljøet, produserer langsiktige SSC linjer, uten forurensendesomatiske celler, og dermed setter påfølgende eksperimentell manipulasjon av SSCS.

Protocol

1. Utarbeidelse av Feeder Cells Vær oppmerksom på at alle reagenser som er beskrevet nedenfor bør være forberedt på sterile mote (se tabell 1 og 2). Denne protokollen sysselsetter JK1 cellelinje (Cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som forer som er en transformert derivat av voksen mus testikler somatiske celler og har blitt beskrevet andre steder 3. Også oppmerksom på at alle dyr prosedyrer skal utføres i samsvar med institusjonelle retn…

Representative Results

Utseendet av passasjen null villtype, er voksen SSC kolonier etter 7 dager er vist i figur 1. Tredimensjonale kolonier består av et lag av flate celler festet til forer eller streke ekstracellulære matrise avsatt av forer med flere lag av SSCS vokser på toppen. Mens friske SSCS er brightly refraktile og jevnt 11-12 um diameter, cellekantene er vanskelig å skille, og størrelsen av koloniene kan være svært variabel, både inne i og mellom brønner fremstilt fra forskjellige mus. Visualisering av ko…

Discussion

Denne metoden for å utlede voksne SSCS med voksne testis-avledet mater celler er robust og har lykkes når vanlige genetiske bakgrunn (f.eks FVB, C57Bl6 og blandet 129SV/C57Bl/6) og ulike mutantstammer var ansatt ^2,3,7,14. Faktisk er mikromiljøet skapt av kulturen systemet tilstrekkelig til å overvinne noen av de genetiske barrierer til å opprettholde voksen SSCS in vivo (for eksempel ved av plzf ^{– / –} dyr) ^7. Mens vi bruker JK1 celler som forer, kan ikke-transforme…

Materials

Name of Reagent/ Material	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	–
			Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
			Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
			Table 3. Stem cell medium
			*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
			**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.