Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em> En vivo</em> Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

Summary

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC), a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método se ha utilizado para seguir la dinámica de expresión estocásticos de un factor de transcripción, el λ represor CI¹.

Abstract

Se describe un método de microscopía de fluorescencia, co-translacional de activación por escisión (COTRAC) a la imagen de la producción de moléculas de proteína en células vivas con precisión una sola molécula sin perturbar la funcionalidad de la proteína. Este método hace posible contar el número de moléculas de proteína producida en una célula durante las ventanas secuenciales, el tiempo de cinco minutos. Se requiere un microscopio de fluorescencia con una densidad de potencia del láser de excitación de ~ 0,5 a 1 kW / cm ^2, que es suficientemente sensible para detectar moléculas individuales de proteínas fluorescentes en células vivas. El reportero fluorescente usada en este método se compone de tres partes: una secuencia de dirección de membrana, una maduración rápida, proteína fluorescente amarilla y una secuencia de reconocimiento de proteasa. El reportero está fusionado traduccionalmente al extremo N-terminal de una proteína de interés. Las células se cultivan en una platina de microscopio de temperatura controlada. Cada cinco minutos, moléculas fluorescentes dentro de las células se crean imágenes (y más tarde coUnted mediante el análisis de imágenes de fluorescencia) y posteriormente photobleached modo que las proteínas recién traducido sólo se cuentan en la siguiente medición.

Imágenes de fluorescencia resultante de este método se puede analizar mediante la detección de manchas fluorescentes en cada imagen, asignándolos a las células individuales y luego asignar células a linajes celulares. El número de proteínas producidas dentro de una ventana de tiempo en una célula dada se calcula dividiendo la intensidad integrada de fluorescencia de las manchas por la intensidad media de las moléculas fluorescentes individuales. Se utilizó este método para medir los niveles de expresión en el intervalo de 0-45 moléculas individuales en 5 min ventanas de tiempo. Este método nos permitió medir el ruido en la expresión del represor CI λ, y tiene otras muchas aplicaciones potenciales en la biología de sistemas.

Protocol

1. Strain Engineering Workflow Inserto que codifica secuencias de (a) una secuencia de localización de membrana, (b) una proteína fluorescente de maduración rápida y (c) una secuencia de reconocimiento de la proteasa N-terminal a y en marco con una proteína de interés (por ejemplo, un factor de transcripción). Se utilizó la membrana dirigida TSR-Venus reportero 2 y fusionado a la secuencia de reconocimiento de la proteasa ubiquitina (Ub) para contar el número de expresadas bacteri…

Representative Results

Los resultados típicos de un experimento de COTRAC seguimiento de la producción de la CI λ represor se muestran en las Figuras 4 y 5. En este experimento, 12 colonias fueron imágenes a intervalos de 5 min. En cada punto de tiempo, la colonia se autofocused primera y centralizada dentro de la región de formación de imágenes. A continuación, la posición centrada / focalizada y se almacenó una imagen de campo claro fue adquirida. La etapa se transloca luego por ~ 0,5 micras a lo …

Discussion

El método COTRAC puede ser generalizado para medir la producción de otras proteínas en la que N-o C-terminales convencionales fusiones de proteínas fluorescentes pueden perturbar la actividad de proteína. La estrategia COTRAC tiene tres ventajas únicas sobre los métodos actuales. En primer lugar, co-traduccional de fusión asegura que una molécula del indicador fluorescente es producida por cada molécula de la proteína de interés, lo que permite un recuento preciso de la producción de proteínas en tiempo re…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Agarose (Low melting temperature)	Lonza	50100
Milli-Q H2O
5×M9 salts			Following recipe described in 9
20% glucose
MgSO4
CaCl2
50×MEM amino acid solution	Invitrogen	11130-051
Temperature-Controlled Growth Chamber Stage adaptor	Bioptechs	FCS-2
Objective Heater	Bioptechs	Model depends on microscope objective
Microaqueduct Slide	Bioptechs	130119-5
Micro cover glasses	VWR	40CIR-1	Can be difficult to source; also available from Bioptechs
Cover glass/slide gasket	Bioptechs	FCS2 0.75 mm
Fluorescence Microscope	Various	Example setup: Coherent Innova 308C Argon-ion laser, Olympus IX-81 microscope, Olympus PlanApo 100X NA 1.45 objective, Metamorph software	Must have laser excitation, automated xyz stage, automation software capable of scripted imaging and autofocus, optics capable of resolving single fluorescent proteins
EM-CCD Camera	Various	Example setup: Andor Ixon DU-898	Must have sufficiently low noise to detect single fluorescent proteins above background